先導(dǎo)分子發(fā)現(xiàn)服務(wù)
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技術(shù)平臺
技術(shù)優(yōu)化服務(wù)
前言
近年來，合成納米抗體庫在篩選出高質(zhì)量納米抗體方面取得了顯著進(jìn)展，這在大量引用文獻(xiàn)中得到了充分體現(xiàn)。本文介紹四個引用高頻的合成納米抗體庫的設(shè)計(jì)策略，并探討其在構(gòu)建和驗(yàn)證過程中所采用的不同方法。
NaLi-H1 噬菌體展示文庫 [1]
Moutel等人（2016年）報(bào)道了第一個完全合成的人源化羊駝單域抗體噬菌體展示庫（NaLi-H1）。該庫選用優(yōu)化的人源化單域抗體（hs2dAb）為支架，具備高度多樣化，能夠無需動物免疫即獲得高親和力的結(jié)合物。NaLi-H1針對多種靶標(biāo)進(jìn)行了篩選，包括熒光蛋白、肌動蛋白、微管蛋白、p53、HP1以及活性RHO GTP酶的構(gòu)象抗體，突顯了該庫在治療應(yīng)用中的潛力。
框架序列選擇和驗(yàn)證：
1. 篩選高度穩(wěn)定的天然納米抗體，并將其碳末端與HA標(biāo)記的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)融合。
2. 通過大量抗生素環(huán)境下菌株的生長情況來評估融合納米抗體的功能性。
3. 選擇一個最優(yōu)框架序列(sdAbD10)，并設(shè)計(jì)人源化版本(hs2dAb)。將這兩種框架分別與Anit-lam1 VHH的CDR嫁接，驗(yàn)證其穩(wěn)定性和功能性。
CDR設(shè)計(jì)：
1. CDR1和CDR2長度固定為7個氨基酸，氨基酸序列的選取模擬自然的多樣性。
2. 降低疏水性氨基酸出現(xiàn)概率，減少聚集傾向。
3. CDR3完全隨機(jī)化，長度覆蓋9、12、15和18個氨基酸。
文庫構(gòu)建：
采用三核苷酸DNA組裝法合成納米抗體基因，插入改造后的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到TG1大腸桿菌菌株。構(gòu)建出含有約30億個重組克隆的文庫，無效克隆率約為4%。
文庫驗(yàn)證：
隨機(jī)選取24個克隆，檢測其溶解性和熱穩(wěn)定性，在被加熱到90°C后，其中70%的克隆能夠恢復(fù)其溶解性。針對多種特性不同的抗原(如mCherry、EGFP、Tubulin、β-actin、p53、HP1α、RhoGTPase等)篩選出高親和力的特異性納米抗體，并證明其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)合功能。通過亞細(xì)胞定位抗體篩選，獲得了能特異性識別HER2細(xì)胞表面區(qū)域的納米抗體。所得納米抗體的親和力范圍從50pM到10nM，與免疫法或親和力成熟獲得的水平相當(dāng)。
酵母表面展示合成納米抗體庫 [2]
McMahon等人（2018）報(bào)道了一種新的合成納米抗體庫，該庫采用基于結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。該工作的重點(diǎn)是開發(fā)了酵母表面展示的體外納米抗體篩選平臺。
框架設(shè)計(jì)：
框架結(jié)構(gòu)來自羊駝基因IGHV1S1-IGHV1S1S5的共識框架。
CDR設(shè)計(jì)：
1. CDR設(shè)計(jì)旨在重現(xiàn)現(xiàn)有納米抗體晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的氨基酸自然多樣性。
2. CDR1中4個位點(diǎn)和CDR2中1個位點(diǎn)進(jìn)行了全面隨機(jī)化。
3. 對于CDR3，采用了3種不同長度(7、11、15個氨基酸)進(jìn)行全面隨機(jī)化。
文庫構(gòu)建：
采用兩步疊加和延伸PCR(OE-PCR)方法構(gòu)建基因文庫。最終構(gòu)建的酵母展示文庫的庫容約估為1×108。對480,000個獨(dú)特序列的分析證實(shí)了隨機(jī)化位置的頻率和變異性符合預(yù)期。使用了一個649個氨基酸的連接肽，包括N端工程化的配偶因子α前體蛋白和C端的GPI錨定序列。大多數(shù)用于分析的納米抗體顯示出高產(chǎn)量(>20 mg/L)。
文庫驗(yàn)證：
功能驗(yàn)證通過選擇針對四類不同抗原的納米抗體來進(jìn)行：2種溶性蛋白(人血清白蛋白和人脂聯(lián)素)和2種膜蛋白(β2AR和A2AR)。獲得了一種對人血清白蛋白高度特異的納米抗體，但親和力較低(430nM)。獲得了幾種特異針對β2AR和A2AR活性、拮抗劑結(jié)合構(gòu)象的納米抗體，親和力在44-151nM之間。
Concave, loop, and convex文庫[3]
Zimmermann等人（2018年）基于對納米抗體晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)分析，特別是對CDR3長度的研究，發(fā)現(xiàn)短的CDR3（6個氨基酸）形成凹形表面，中等長度的CDR3（12個氨基酸）表現(xiàn)出“環(huán)”的突起，而較長的CDR3（16個氨基酸）則呈現(xiàn)凸形表面。基于這一研究，他們選擇了幾種先前報(bào)道的納米抗體作為模板，為每種結(jié)合表面形狀構(gòu)建一個合成文庫。
框架設(shè)計(jì)：
基于這些觀察，研究者從先前報(bào)道的納米抗體中選出適應(yīng)每種結(jié)合形狀的納米抗體作為框架模板。為了驗(yàn)證這些框架的穩(wěn)定性，在隨機(jī)化的位置上生成了絲氨酸和蘇氨酸突變體，保持疏水核心和施加構(gòu)象限制的氨基酸（如脯氨酸）不變。結(jié)果顯示，突變體納米抗體的熔點(diǎn)（Tm）相比其前體顯著提高了21–35°C。
CDR設(shè)計(jì)：
1. 針對CDR區(qū)域采用了不同的三核苷酸混合物，以平衡帶電、極性、芳香族和非極性氨基酸，調(diào)整整體的疏水性。這樣可以降低選擇膜蛋白時粘性結(jié)合體的富集，并減少聚集的可能性。
2. 三種庫的理論多樣性分別為凸面庫8.3×10^17、環(huán)狀庫4.3×10^19和凹面庫2.8×10^22。
文庫構(gòu)建：
通過組裝PCR生成含有CDR的DNA片段，然后采用Type IIS限制酶進(jìn)行兩步連接構(gòu)建三個文庫。使用核糖體顯示技術(shù)表達(dá)這些文庫，該方法允許更大的文庫規(guī)模(9×1012)。
文庫驗(yàn)證：
針對4種不同抗原(MBP、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TM287/288、ENT1和GlyT1)進(jìn)行了驗(yàn)證。從各個文庫中篩選到了針對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親和力達(dá)0.5 nM的納米抗體。對TM287/288的選擇過程進(jìn)行了優(yōu)化，得到了親和力達(dá)2nM的納米抗體。針對GlyT1和ENT1等難靶標(biāo)，也成功篩選到了高親和力的納米抗體。這些結(jié)果表明合理設(shè)計(jì)的CDR和包含多種CDR3長度，是獲得針對各種抗原的高親和力合成納米抗體的有效策略。
CeVICA文庫 [4]
Chen等人（2020年）基于1030個Nbs序列和298個晶體結(jié)構(gòu)分析,開發(fā)了CeVICA（無細(xì)胞VHH鑒定與聚類分析）平臺。該平臺結(jié)合了合成納米抗體庫、核糖體展示以及通過CDR定向聚類分析進(jìn)行的計(jì)算預(yù)測。與先前的研究不同，這項(xiàng)工作不僅設(shè)計(jì)了合成納米抗體庫，還將體外親和力成熟整合進(jìn)入計(jì)算。
框架設(shè)計(jì)：
1. 設(shè)計(jì)了由不同版本的框架段組成的組合框架，包括3個版本的frame1、1個版本的frame2、3個版本的frame3和1個版本的frame4。
2. 這些框架的版本分別源自：從分析的天然Nb集合中提取的共識序列；天然Nb A310；一種與GFP結(jié)合的納米抗體。
CDR設(shè)計(jì)：
1. CDR長度的選擇與以前的研究略有不同，分別為CDR1包含7個氨基酸、CDR2包含5個氨基酸、CDR3包含6、9、10或13個氨基酸，這些長度與天然Nb中觀察到的最常見CDR長度相匹配。
2. 在所有隨機(jī)化位點(diǎn)使用了所有氨基酸，包括半胱氨酸。
文庫構(gòu)建：
使用核糖體展示技術(shù)獲得了3.7 × 1011個完整序列的多樣性文庫。
文庫驗(yàn)證：
通過三輪篩選，分別獲得了針對EGFP和SARS-CoV-2 spike蛋白受體結(jié)合域(RBD)的納米抗體。
基于CDR相似性對獲得的納米抗體進(jìn)行聚類分析，排除了針對兩種抗原的共同結(jié)合體。在16個獲得的納米抗體中，3個為強(qiáng)結(jié)合，8個為弱結(jié)合，3個為非結(jié)合。6個納米抗體(3個強(qiáng)結(jié)合、3個弱結(jié)合)在使用SARS-CoV-2 Spike假病毒的中和實(shí)驗(yàn)中顯示>30%的抑制作用。經(jīng)過體外成熟化過程，最強(qiáng)的中和抑制劑的IC50達(dá)到62.7nM，與在人類患者中發(fā)現(xiàn)的抗體相當(dāng)。
小結(jié)
在過去的二十年中，合成納米抗體庫在一個由免疫庫主導(dǎo)的領(lǐng)域中逐漸占據(jù)了一席之地，目前已有一個合成庫（NaLi-H1）被商業(yè)化應(yīng)用。這些庫的成功案例展示了合成方法在生成具備高親和力和穩(wěn)定性的納米抗體方面的巨大潛力。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的持續(xù)優(yōu)化，預(yù)計(jì)合成納米抗體庫在未來的醫(yī)學(xué)診斷和治療中將扮演越來越重要的角色。
參考文獻(xiàn)：
[1]. Moutel S, Bery N, Bernard V, Keller L, Lemesre E, de Marco A, Ligat L, Rain JC, Favre G, Olichon A, Perez F. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 2016 Jul 19;5:e16228. doi: 10.7554/eLife.16228.
[2]. McMahon C, Baier AS, Pascolutti R, Wegrecki M, Zheng S, Ong JX, Erlandson SC, Hilger D, Rasmussen SGF, Ring AM, Manglik A, Kruse AC. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6.
[3]. Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 2018 May 24;7:e34317. doi: 10.7554/eLife.34317.
[4]. Chen, X., Gentili, M., Hacohen, N. et al. A cell-free nanobody engineering platform rapidly generates SARS-CoV-2 neutralizing nanobodies. Nat Commun 12, 5506 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25777-z
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