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前言  

目前較為常見(jiàn)的用藥方式有五種：口服、注射、吸入（治療哮喘的藥）、局部用藥（各種膏藥）和滴鼻。其中以口服和注射最為常見(jiàn)。那么藥物從進(jìn)入人體到消耗殆盡需要多長(zhǎng)時(shí)間呢？這時(shí)就要引入半衰期這個(gè)概念了。半衰期就是從注射完畢開(kāi)始算起，到血漿內(nèi)藥物剩一半所需要的時(shí)間。請(qǐng)注意，談到半衰期，都是指“血漿內(nèi)”的藥物濃度。常規(guī)抗體通常半衰期較長(zhǎng)，因?yàn)榉肿恿枯^大，而且能夠特異性地和FcRn結(jié)合（圖1），而FcRn能夠保護(hù)抗體不被溶酶體降解，抗體隨FcRn轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面后失去與FcRn的結(jié)合，重新釋放進(jìn)入血漿，從而延長(zhǎng)了抗體的半衰期^[1]。與常規(guī)抗體相比，納米抗體最大的短板是血漿內(nèi)的半衰期非常短，雖然這使得其在體內(nèi)成像方面大展身手，但限制了其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，如何提高納米抗體的半衰期是納米抗體在體內(nèi)應(yīng)用的一大瓶頸。

圖1. FcRn對(duì)IgG代謝的調(diào)控機(jī)制

納米抗體的半衰期

自從1993年首次報(bào)道以來(lái)，大量的研究表明納米抗體具有很好的應(yīng)用前景，尤其是在很多疾病的診斷和治療方面，納米抗體都有著不俗的表現(xiàn)。然而對(duì)于蛋白藥物來(lái)說(shuō)，腎小球的濾過(guò)界限一般在60kDa左右。也就是說(shuō)小分子量的抗體片段或衍生物，例如納米抗體（15kDa）和scFv（28kDa）甚至Fab（50kDa）都會(huì)通過(guò)腎小球的濾過(guò)作用從體內(nèi)清除，導(dǎo)致其擁有較短的半衰期。其中，納米抗體在所有抗體類(lèi)型中分子量最小，半衰期往往只有幾十分鐘。

圖2. 不同形式的抗體的結(jié)構(gòu)及分子量

常用的納米抗體半衰期延長(zhǎng)方案

目前關(guān)于納米抗體延長(zhǎng)半衰期的方法主要有以下幾種方式：①通過(guò)偶聯(lián)聚乙二醇（PEG）的方法提高蛋白自身的分子量。②將納米抗體直接與抗體Fc區(qū)相連成融合蛋白。③將納米抗體與抗HSA的納米抗體串聯(lián)；④多個(gè)納米抗體串聯(lián)形成多價(jià)和多特異性納米抗體。就目前已上市和在研的納米抗體藥物來(lái)看，大多是選擇將納米抗體和Fc或者人血清白蛋白HSA融合這種方式來(lái)彌補(bǔ)半衰期短的問(wèn)題，接下來(lái)就這兩種方式詳細(xì)介紹原理和效果。

納米抗體與HSA結(jié)合

1. HSA的特點(diǎn)

HSA的X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)顯示，它是一個(gè)心形分子，含有585個(gè)氨基酸，它主要由α -螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，缺乏β -折疊，組合成三個(gè)同源域DI, DII和DIII，其中每個(gè)被分為A和B子域 (DIA, DIB, DIIA, DIIB, DIIIA和DIIIB)，這些域由長(zhǎng)而柔性的環(huán)連接^[3]。

圖3. 白蛋白的三維結(jié)構(gòu)

HSA是人體血漿中含量最豐富、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其濃度約為45 mg/ml (0.6 mM)，循環(huán)半衰期長(zhǎng)達(dá)20天。納米抗體與HSA結(jié)合后（圖4），流體力學(xué)半徑和分子量增加，腎小球過(guò)濾減少，體內(nèi)滯留時(shí)間將大大延長(zhǎng)；同時(shí)借助FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)作用，半衰期可由數(shù)小時(shí)延長(zhǎng)至3周以上。

圖4.白蛋白-納米抗體非共價(jià)結(jié)合復(fù)合體示意圖 

2. 納米抗體與HSA結(jié)合

引入抗HSA的VHH，介導(dǎo)藥物與HSA的結(jié)合可以有效提高藥物的半衰期。目前已經(jīng)報(bào)道了一系列基于抗腫瘤抗原、抗CD16和抗HSA納米體的雙特異性納米抗體。其中由Ablynx開(kāi)發(fā)的人源化、三價(jià)的雙特異性納米抗體Ozoralizumab于2022年9月在日本獲批（英文商品名：Nanozora^?），這也是全球首款獲批上市的雙特異性納米抗體。Ozoralizumab含有3個(gè)納米抗體結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)靶向TNF-α，1個(gè)與HSA結(jié)合延長(zhǎng)藥物半衰期，單次給藥后平均半衰期t1/2為18.2天。

圖5.Ozoralizumab結(jié)構(gòu)示意圖

另外，君實(shí)生物自Anwita Biosciences引進(jìn)的JS014是一款創(chuàng)新納米抗體，其活性成分為重組白介素21-抗人血清白蛋白（HSA）納米抗體融合蛋白， JS014 高親和力特異性地結(jié)合人 IL-21R 并激活淋巴細(xì)胞，通過(guò)融合抗 HSA 的單域抗體使 IL-21 的半衰期得到顯著延長(zhǎng)。目前JS014正在開(kāi)展晚期惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)。

納米抗體偶聯(lián)抗體Fc片段

1. 抗體Fc片段的結(jié)構(gòu)和功能

抗體Fc片段是抗體的恒定區(qū)，在這個(gè)恒定區(qū)域內(nèi)氨基酸的序列在不同的抗體中呈現(xiàn)相同的狀態(tài)，抗體的不同類(lèi)型，由抗體FC片段的特異性結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)一步?jīng)Q定。納米抗體除了半衰期短，由于缺乏單克隆抗體的Fc片段，不具備Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，如抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（ADCC）效應(yīng)和血清穩(wěn)定性。自然殺傷細(xì)胞（NK）是介導(dǎo)ADCC作用的主要免疫細(xì)胞，其細(xì)胞表面的Fc受體FcγRIIIa（CD16a）在識(shí)別和結(jié)合Fc中起關(guān)鍵作用。

2. 納米抗體偶聯(lián)Fc片段的研究

納米抗體可以很容易偶聯(lián)Fc片段重組人源化重鏈抗體形式，以實(shí)現(xiàn)包括Fc介導(dǎo)的效應(yīng)因子功能，并增加血液滯留時(shí)間，但也將不可避免地降低其擴(kuò)散優(yōu)勢(shì)。選擇Fc融合片段，更傾向于選擇IgG1 Fc，這和IgG1與Fc受體蛋白的親和力結(jié)合特性有關(guān)。

2.1 康寧杰瑞KN035

應(yīng)用Fc融合技術(shù)最成功的納米抗體藥物當(dāng)屬康寧杰瑞的恩維達(dá)^?（KN035）。這是康寧杰瑞自主研發(fā)的PD-L1單域抗體Fc融合蛋白，也是全球第一個(gè)獲批上市的皮下注射PD-(L)1抗體，適用于不可切除或轉(zhuǎn)移性微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷型（dMMR）的成人晚期實(shí)體瘤患者的治療^[9]。KN035的PD-L1結(jié)合分子中包含免疫球蛋白Fc區(qū)可以使所述結(jié)合分子形成二聚體，同時(shí)延長(zhǎng)所述分子的體內(nèi)半衰期，約為200小時(shí)。

圖7. KN035的晶體結(jié)構(gòu)

2.2 復(fù)宏漢霖HLX53

2022年12月9日，復(fù)宏漢霖宣自主開(kāi)發(fā)的創(chuàng)新型抗TIGIT的Fc融合蛋白（由納米抗體和野生型 IgG1的Fc端組成）在晚期/轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤及淋巴瘤患者中開(kāi)展的I期臨床試驗(yàn)（NCT05394168）完成首例受試者給藥。臨床前研究結(jié)果表明，HLX53具有優(yōu)異的腫瘤抑制效果且安全性良好^[11]。目前，全球范圍內(nèi)尚無(wú)同類(lèi)抗TIGIT的Fc融合蛋白藥物獲批上市。

圖8. HLX53的抗體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

納米抗體 PEG化

1. 什么是PEG？

聚乙二醇（PEG）是一種以-CH2-CH2-O-為重復(fù)單元的水溶性的聚醚，其結(jié)構(gòu)圖如圖9所示，在常溫下，根據(jù)分子量的不同，PEG會(huì)從黏流的液體到版結(jié)晶的固體。PEG具有很低的免疫原性/抗原性和毒性。PEG化修飾（PEGylation）是將PEG共價(jià)結(jié)合在藥物上，以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和免疫學(xué)特性，從而增強(qiáng)其治療效果的一種藥物技術(shù)。PEG化修飾會(huì)改變藥物的物理化學(xué)性質(zhì)，包括構(gòu)象、靜電結(jié)合、疏水性等。這些物理和化學(xué)變化增加了藥物的體內(nèi)保留時(shí)間，提高血漿半衰期，延長(zhǎng)吸收時(shí)間，還能影響藥物與細(xì)胞受體的結(jié)合親和力，改善腫瘤靶向性。藥物經(jīng)PEG修飾后可減少給藥次數(shù)、提高療效、改善耐受性、降低嚴(yán)重程度和不良事件發(fā)生率。同時(shí)PEG還可以增加蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性，有利于藥物的生產(chǎn)和儲(chǔ)存。因此PEG常被用作藥物傳遞和藥物修飾技術(shù)，可以直接與藥物偶聯(lián)，或附著在藥物表面一起封裝于納米材料里。

圖9. 代表性的PEG結(jié)構(gòu)

2. 納米抗體PEG化研究

ATN-192 是Ablyx 在Ozoralizumab 基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的一種第二代TNFα 納米抗體，即PEG修飾的長(zhǎng)效版本，目前已經(jīng)完成臨床一期。 

其他提高納米抗體半衰期的策略

1. 多價(jià)納米抗體

科望生物第二款抗體藥OX40抗體ES102的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)獲得NMPA受理。ES102是繼信達(dá)生物IBI101、麗珠單抗、恒瑞醫(yī)藥SHR-1806之后第4款申報(bào)臨床的OX40抗體。ES102是一種六價(jià)納米抗體的Fc融合蛋白（圖10）。其獨(dú)特設(shè)計(jì)使得ES102即便在沒(méi)有外源性交聯(lián)的情況下也能強(qiáng)效激活OX40通路。據(jù)悉，與傳統(tǒng)的二價(jià)或四價(jià)OX40抗體相比較，ES102具有很強(qiáng)的免疫激活能力，并且已經(jīng)在臨床前顯示出顯著的單藥及聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1抗腫瘤藥效，同時(shí)在臨床前安全性評(píng)價(jià)中也展現(xiàn)了良好的安全性特征。目前， ES102正在開(kāi)展其在臨床I期試驗(yàn)。

圖 10. ES102的抗體結(jié)構(gòu)

2. 納米抗體偶聯(lián)鐵蛋白“Fenobody”

將納米抗體展示在鐵蛋白表面，利用鐵蛋白亞基的自組裝特性而形成的一種籠狀蛋白殼。鐵蛋白是一種由24個(gè)亞基自組裝形成的外徑為12納米、內(nèi)徑為8納米的籠狀蛋白。在該工作中，研究人員利用基因工程手段將納米抗體連接到鐵蛋白亞基的C端。結(jié)果表明，自組裝的鐵蛋白亞基成功將納米抗體以24聚化的形式展示在一個(gè)鐵蛋白殼表面。

研究人員通過(guò)電鏡觀(guān)察Fenobody，發(fā)現(xiàn)納米抗體以4個(gè)一簇、一共6簇的形式展示在鐵蛋白表面，而且成簇的納米抗體在空間結(jié)構(gòu)上能夠很靈活地暴露抗原結(jié)合位點(diǎn)。展示納米抗體后的Fenobody尺寸增大為21 nm，與抗H5N1納米抗體相比，F(xiàn)enobody對(duì)H5N1抗原的表面親和力提高了360倍。他們還在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)比納米抗體，F(xiàn)enobody的體內(nèi)循環(huán)半衰期延長(zhǎng)了10倍以上。同時(shí)，F(xiàn)enobody在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可溶性高效表達(dá)，并且具有極好的熱穩(wěn)定性，Tm值達(dá)到80攝氏度以上^[12]。

圖11. Fenobody的結(jié)構(gòu)和體內(nèi)半衰期

小結(jié)  

納米抗體因分子量小，半衰期非常短，限制了其臨床應(yīng)用。目前，已經(jīng)有很多方法可以有效改造以延長(zhǎng)半衰期， 其中包括Fc融合、PEG化、白蛋白融合及多價(jià)納米抗體融合等方法，部分方法已經(jīng)取得臨床獲批或在臨床試驗(yàn)階段。相信未來(lái)還會(huì)有更多科學(xué)有效的方法出現(xiàn)，也希望能有更多的納米抗體藥物推向臨床并且上市，推動(dòng)人類(lèi)健康事業(yè)的發(fā)展。

參考資料：

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