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納米抗體在抗體藥與細(xì)胞治療領(lǐng)域備受關(guān)注，文獻(xiàn)中常提到三種動物：駱駝（Camel），羊駝（Alpaca），美洲駝(llama)，這三種動物該如何選擇？它們在抗體序列上又有什么區(qū)別呢？以下將詳細(xì)介紹：

駱駝，羊駝，美洲駝都屬于駱駝科，駱駝科Camelidae僅3屬6種，分布于亞洲和非洲（駱駝族Camelini）以及南美洲（羊駝族Lamini），駱駝族是從北美洲進(jìn)入亞洲和非洲的一支的后代，體型大，有駝峰，適應(yīng)沙漠生活，現(xiàn)存有2～3種，即單峰駝Camelus dromedarius，雙峰駝Camelus bactrianus和野駱駝Camelus ferus：單峰駝分布于中東和北非，駝峰1個，現(xiàn)存僅有家畜，野生的早已滅絕，但是有些再次被野化，如引入澳大利亞的單峰駝現(xiàn)在在澳洲沙漠中形成了一定規(guī)模的野生種群；雙峰駝和野駱駝分別指家畜和野生的雙峰駝，駝峰2個，分布于亞洲中部，后者駝峰較小，毛較短，四肢則較長，數(shù)量非常稀少。羊駝族是從北美洲進(jìn)入南美洲的一支的后代，體型較小，無駝峰，分布于安第斯山區(qū)和南美洲南部的草原、半荒漠地區(qū)，其中家羊駝Lama glama和小羊駝Lama pacos為家畜，色系品種較豐富。

駝科動物分類

駱駝科的分類形式如下：

駱駝屬（camelus）

雙峰駝Camelus bactrianus

單峰駝Camelus dromedarius

羊駝屬（Lama）

大羊駝（美洲駝）Lama glama=Llama

原駝Lama guanicoe

小羊駝屬（Vicugna）

駱馬Vicugna vicugna

羊（小羊駝）Vicugna pacos=Alpaca=Lama pacos

駱駝是最好區(qū)分的，羊駝與美洲駝最大的區(qū)別在于個體大小，羊駝一般成年體重能達(dá)到60Kg，而美洲駝可以達(dá)到約127-204千克， llama 腿毛比較少，耳朵呈香蕉形彎曲且比較大，臉上毛比較短。而alpaca腿毛比較厚實(shí)，耳朵直立比較大且短，臉上毛與身體一樣比較厚。

駝科動物體內(nèi)單域抗體含量

三種動物中以駱駝體內(nèi)單域抗體含量最高，約70%，而羊駝與美洲駝體內(nèi)單域抗體的含量約25%~45%之間，從擴(kuò)增VHH 片段的PCR的結(jié)果可以很明顯的看到，這也反應(yīng)了駱駝可以更容易篩選到納米抗體。

                                     （以上數(shù)據(jù)來源于NBbiolab的Large VHH Na?ve libraries數(shù)據(jù)）                                            

駝科動物體內(nèi)抗體分類

駱駝科體內(nèi)既有常規(guī)抗體IgG1（兩種重鏈，兩條輕鏈），還有單域重鏈抗體，其結(jié)構(gòu)只有重鏈且恒定區(qū)缺失CH1。

根據(jù)鉸鏈區(qū)的不同我們可以將駱駝科的抗體分為如下亞型：

其中IgG2與IgG3 屬于單域重鏈抗體，三種動物體內(nèi)抗體亞型分別如下，

Alpaca：IgG1a，IgG1b，IgG2b，IgG2C

Llama：IgG1a，IgG1b，IgG2b，IgG2C

Camel：IgG1a，IgG1b，IgG2a，IgG2c，IgG3

單域重鏈抗體Germline 數(shù)據(jù)

從IMGT數(shù)據(jù)庫中可以知道Camel（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=genetable&species=arabian_camel&group=IGHV）IGHV3S1 to IGHV3S41, is conventional tetrameric IgG1. IGHV3S42 to IGHV3S74, is single domain heavy chain antibody，共計33條

Alpaca

（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=genetable&species=Vicugna_pacos&group=IGHV）

IGHV3-3 and IGHV3S53 to IGHV3S68 is single domain heavy chain antibody，共計，共計17條

Llama

（http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=genetable&species=Llama&group=IGHV）

IGHV3S1 to IGHV3S5 is single domain heavy chain antibody，共計5條

從Germline 數(shù)據(jù)中可以知道Camel 抗體具有更高的多樣性。

特征氨基酸

傳統(tǒng)抗體的FR2中，V42、G49，L50和W52這4個氨基酸殘基參與VL的相互作用，而VHH 這四個位置發(fā)生了突變，突變?nèi)缦卤恚?/p>

Camel VHH FR2-amino acid positions

Alpaca VHH FR2-amino acid positions

Llama FR2-amino acid positions

以上數(shù)據(jù)統(tǒng)計來源于NBbiolab的Large VHH Na?ve libraries NGS數(shù)據(jù)

分子內(nèi)二硫鍵與豐度

VHH除了正常的23位與104位形成二硫鍵外，常常在CDR1或FR2與CDR3之間形成額外的一對二硫鍵，這對二硫鍵起到穩(wěn)定抗體結(jié)構(gòu)的作用，雖然能夠讓抗體保持很好的穩(wěn)定性，但是在工藝開發(fā)上往往容易導(dǎo)致二硫鍵的錯配，如果突變掉以后，抗體就丟失活性。查詢Ablyx的專利，發(fā)現(xiàn)Ablyx公開的序列中未發(fā)現(xiàn)兩對二硫鍵的序列。Camel，Alpaca，llama 在額外二硫鍵的位置與豐度上有很大的不同。

Camel 前面已經(jīng)介紹了血清單域抗體含量高，且抗體Germline更豐富，但是除了IGHV3S42以外，剩下32條都含有額外二硫鍵，其中IGHV3S43~ IGHV3S71 二硫鍵的位置在CDR1~CDR3，IGHV3S72~ IGHV3S474二硫鍵的位置在FR2的50位氨基酸~CDR3.采用NGS 分析NBbiolab的Phage & Yeast display based Na?ve VHH libraries from Camelus bactrianus，發(fā)現(xiàn)85%以上的序列都含有兩對二硫鍵。

Alpaca 17條Germline中，有8條含有兩對二硫鍵，額外二硫鍵的位置在55位與CDR3之間，采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Na?ve VHH libraries from Alpaca，發(fā)現(xiàn)32%的序列有兩對二硫鍵。

Llama 5條Germline中，3條有兩對二硫鍵，額外二硫鍵的位置在55位與CDR3之間，采用NGS 分析NBbiolab的Phage display based Na?ve VHH libraries from llama，發(fā)現(xiàn)22.3%的序列有兩對二硫鍵，與文獻(xiàn)中報道的llama是這三個物種血清中二硫鍵最低的一致。

納米抗體與human VH同源性

Camel VHH與human VH同源性在67.5%~74.3%之間，而Alpaca，llama與human VH的同源性在80%~87.3%之間。

參考文獻(xiàn)：

1. Ciccarese S,et al. The Camel Adaptive Immune Receptors Repertoire as a Singular  Example of Structural and  Functional Genomics. Frontiers in Genetics. 2019.00997

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