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前言

在細(xì)胞治療中，CAR識(shí)別表位對(duì)于免疫治療效果有非常重要影響。目前CAR-T在實(shí)體瘤治療中發(fā)展較為緩慢，B7-H3是一個(gè)新興的CAR-T實(shí)體瘤治療靶點(diǎn)，其胞外域包含兩個(gè)不同的表位基序：IgC和IgV。本文介紹一項(xiàng)基于納米抗體的B7-H3 CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品，該產(chǎn)品亮點(diǎn)是其中的中B7-H3納米抗體識(shí)別IgC而非IgV表位而對(duì)小鼠實(shí)體瘤模型表現(xiàn)出更加有效的抗腫瘤活性。

4IgB7-H3是實(shí)體瘤中的主要亞型

人B7-H3包括兩種亞型，2IgB7-H3 (2Ig)和4IgB7-H3 (4Ig)。檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn)，B7-H3在各種腫瘤組織及細(xì)胞系中異常高表達(dá)，并與胰腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者低的總生存期相關(guān)。而4IgB7-H3亞型是在胰腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種實(shí)體瘤類型中表達(dá)的主要亞型，且4Ig是高度糖基化的（圖1），這也表明4IgB7-H3亞型可以作為癌癥免疫治療的泛癌靶點(diǎn)。

圖1. 4IgB7-H3在多種實(shí)體癌中高度過表達(dá)

靶向B7-H3納米抗體開發(fā)

使用噬菌體展示技術(shù)從8個(gè)單峰駱駝VHH納米抗體庫((>1E12 pfu/ml total) 中篩選出針對(duì)4IgB7-H3的納米抗體。獲得10個(gè)克隆與人4IgB7-H3蛋白結(jié)合，通過ELISA、動(dòng)力學(xué)抗體結(jié)合、WB和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中高親和力的納米抗體C4、B12和G8與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的天然4IgB7-H3結(jié)合（圖2）。

圖2 4IgB7-H3高親和力納米抗體開發(fā)

靶向B7-H3納米抗體識(shí)別表位鑒定

通過在Octet平臺(tái)上進(jìn)行4IgB7-H3抗原的交叉競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，G8和已知的抗B7-H3的單克隆抗體376.96在4IgB7-H3的IgV結(jié)構(gòu)域具有重疊表位。通過研究從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中純化的抗原片段與VHH-Fc的相互作用，發(fā)現(xiàn)B12和C4與4IgB7-H3 IgC結(jié)構(gòu)域的不同區(qū)域結(jié)合（圖3）。

圖3 抗B7-H3納米抗體的表位預(yù)測(cè)

基于B7-H3納米抗體的CAR-T細(xì)胞在體外殺傷人胰腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

將單個(gè)VHH片段插入到臨床上使用的CAR載體中來生成B7-H3 CAR-T細(xì)胞，而后將其與腫瘤細(xì)胞系共孵育，發(fā)現(xiàn)它以抗原依賴的方式顯著殺傷胰腺癌（Panc-1）和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（IMR32、IMR5）。盡管基于納米抗體的CAR-T細(xì)胞和基于376.96 scFv的CAR-T細(xì)胞對(duì)IMR5腫瘤細(xì)胞具有相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，但B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）水平明顯更高。抗原結(jié)合能力和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)表明，B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞具有更高的抗原結(jié)合能力，且天然4IgB7-H3抗原參與細(xì)胞功能的激活。通過CAR-Jurkat NF-κB和NFAT報(bào)告細(xì)胞系評(píng)估發(fā)現(xiàn)B12（VHH）-CAR激活活性最強(qiáng)，可能的原因是因?yàn)槠涓鼜?qiáng)的抗原結(jié)合能力（圖4）。

圖4 基于B7-H3納米抗體的CAR-T細(xì)胞在體外有效殺傷胰腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

基于B7-H3納米抗體的CAR-T細(xì)胞根除小鼠胰腺癌

為了臨床前評(píng)估基于B7-H3納米抗體的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功效，在20天后向Panc-1轉(zhuǎn)移異種移植小鼠模型單次注射250-1000萬個(gè)CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞和C4（VHH）-CAR-T均能顯著消除腫瘤負(fù)荷。治療后再次激發(fā)腫瘤，發(fā)現(xiàn)腫瘤快速縮小，表明小鼠體內(nèi)已具有持久性的CAR-T活性。在250萬個(gè)CAR-T細(xì)胞劑量下，發(fā)現(xiàn)靶向B7-H3 IgC結(jié)構(gòu)域的B12（VHH）-CAR-T和C4（VHH）-CAR-T細(xì)胞相較于靶向B7-H3 IgV的376.96（scFv）-CAR-T和G8（VHH）-CAR-T細(xì)胞對(duì)Panc-1保持了更高的抗腫瘤療效，從而延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。類似的，250萬個(gè)B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞可以顯著消退原位胰腺癌小鼠模型中的Panc-1原位腫瘤（圖5）。

圖5 基于B7-H3納米抗體的CAR-T細(xì)胞在小鼠中對(duì)人胰腺癌抗腫瘤活性

B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞對(duì)小鼠轉(zhuǎn)移性和大實(shí)體瘤具有最強(qiáng)的抗腫瘤活性

研究發(fā)現(xiàn)B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷，對(duì)小鼠模型中的IMR5轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細(xì)胞瘤、大至400-800 mm3的NBEB神經(jīng)母細(xì)胞瘤異種移植瘤和大至250 mm3的BxPC-3胰腺癌異種移植瘤均表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，且這種抑制是B7-H3靶向性的。而C4（VHH）-CAR-T和376.96（scFv）-CAR-T細(xì)胞僅顯示出有限的療效（圖6）。

圖6 B12（VHH）-CAR-T細(xì)胞抑制異種移植中轉(zhuǎn)移性和大型腫瘤生長(zhǎng)

小結(jié)

B7-H3在各種實(shí)體瘤中異常過表達(dá)，其4IgB7-H3亞型作為常見亞型，是開發(fā)免疫治療的潛在靶點(diǎn)。本研究報(bào)道的靶向B7-H3的納米抗體可以與4Ig和2Ig蛋白結(jié)合，其中基于B12 (VHH)的CAR-T細(xì)胞識(shí)別4IgB7-H3 IgC結(jié)構(gòu)域中的獨(dú)特表位，對(duì)小鼠晚期轉(zhuǎn)移性和大型實(shí)體腫瘤具有良好的抗腫瘤作用。這項(xiàng)研究證明了基于VHH的CAR-T細(xì)胞治療包括胰腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的實(shí)體瘤的潛力，并為在CAR-T細(xì)胞治療中CAR識(shí)別表位影響提供一種解決策略。

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參考文獻(xiàn)：

Li, D., Wang, R., Liang, T. et al. Camel nanobody-based B7-H3 CAR-T cells show high efficacy against large solid tumours. Nat Commun 14, 5920 (2023). doi: https://doi.org/10.1038/s41467-023-41631-w

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