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前言  
自1986年第一個(gè)治療性抗體進(jìn)入臨床后，越來越多的治療性抗體得到迅速發(fā)展，抗體藥也成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)重要的組成部分。大多數(shù)抗體藥物的給藥方式為靜脈注射，少數(shù)為皮下注射或肌肉注射。其給藥方式的限制，桎梏了較多靶點(diǎn)的臨床廣泛應(yīng)用。而1989年從駱駝科中發(fā)現(xiàn)的納米抗體，不僅刷新了人類對(duì)抗體的認(rèn)識(shí)，更給抗體藥的給藥方式帶來了革新，發(fā)現(xiàn)更多的給藥方式可通過其實(shí)現(xiàn)。小編今天為大家介紹納米抗體藥物在吸入式給藥、皮下注射給藥、口服遞送以及跨血腦屏障遞送中的應(yīng)用研究。

VHH結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及給藥優(yōu)勢(shì)

納米抗體是在駱駝科及鯊魚科動(dòng)物血清中大量存在的天然重鏈抗體(HcAb)的可變結(jié)構(gòu)域(VHH/IgNAR)，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。

圖2KN035/PD-L1整體結(jié)構(gòu)[3](a為KN035序列和結(jié)構(gòu)，b為KN035/PD-L1結(jié)合結(jié)構(gòu)

納米抗體吸入式給藥

吸入式給藥是指一些氣體及揮發(fā)性藥物經(jīng)過呼吸道直接進(jìn)入肺泡，由肺泡表面吸收，產(chǎn)生全身作用的給藥方式。由于肺泡表面積大，又與血液只隔肺泡上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮各一層，且毛細(xì)血管內(nèi)血流量又大，故吸收迅速。氣體或揮發(fā)性藥物吸入后，由肺上皮和呼吸道黏膜吸收，對(duì)肺部疾病可使藥物直接作用于病變部位。傳統(tǒng)抗體的吸入式遞送存在挑戰(zhàn)性，并且其抗體需要具有制備和遞送所需的有利物理化學(xué)性質(zhì)。

1.治療新冠感染的作用機(jī)制及案例

自2019年12月開始，一種新型、高傳染性的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2，COVID-19）在全球范圍內(nèi)爆發(fā)，已造成數(shù)億人感染。與其他人畜共患冠狀病毒（SARS-CoV-1、MERS）一樣，新型冠狀病毒表達(dá)一種表面Spike (S)糖蛋白，該蛋白由兩個(gè)亞基S1和S2組成，形成同源三聚體S蛋白。這種同源三聚體S蛋白可以與宿主細(xì)胞相互作用。新型冠狀病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用是由S1亞基的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）介導(dǎo)的，該結(jié)構(gòu)域與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE 2）的肽酶結(jié)構(gòu)域（PD）結(jié)合。之后，S2亞基發(fā)生了劇烈的構(gòu)象變化，并引發(fā)了膜融合。新型冠狀病毒S蛋白與ACE2（Kd為15 nM）的結(jié)合親和力是SARS-CoV-1 S蛋白的10-20倍，推測(cè)這可能是SARS-CoV- 2更具傳染性的原因^[3]。

盡管傳統(tǒng)單克隆抗體的治療能夠減緩病者的病情，但其高劑量的使用也反映出靜脈給藥效率低，同時(shí)傳統(tǒng)的單克隆抗體不能快速、低成本地生產(chǎn)，也不能快速開發(fā)針對(duì)突變病毒株的抗體藥物，不易優(yōu)化。而具有優(yōu)良理化性能的納米抗體則能很好的解決這些問題。它們可以霧化，吸入給藥，并直接應(yīng)用于感染部位，肺部藥物濃度高，高生物利用度，只需少量藥物就能達(dá)到效果，既降低用藥成本，也降低副作用發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，在治療呼吸道病毒方面具有非常潛力。

圖3 新冠病毒結(jié)構(gòu) https://cn.bing.com/images

2020年 UCSF Michael Schoof團(tuán)隊(duì)報(bào)道了AeroNabs分子氣霧劑，基于合成文庫(kù)中篩選出的納米抗體分子，可與鼻噴霧劑或吸入器一起用于個(gè)人預(yù)防2019冠狀病毒病（COVID-19）。該納米體能夠破壞SARS-CoV-2棘突與宿主細(xì)胞受體的相互作用。

來自匹茲堡大學(xué)的項(xiàng)宇飛和合作者用重組SARS-CoV-2 RBD免疫駱駝，使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法和質(zhì)譜分析，鑒定了大量高效的SARS-CoV-2中和納米抗體。研究發(fā)現(xiàn)，幾種納米抗體在極低的劑量下中和了SARS-CoV-2，半抑制濃度低于pmol。他們構(gòu)建了多價(jià)VHHs，并實(shí)現(xiàn)了超高的中和效率（半抑制濃度低至0.058 ng/ml），并可能防止突變病毒株逃逸。這些熱穩(wěn)定的VHHs可以由微生物快速大量生產(chǎn)，并且能夠抵抗冷凍、干燥和霧化。他們進(jìn)一步將最有效的三價(jià) Tri-Nb21開發(fā)成PiN-21氣溶膠，可以有效預(yù)防和治療感染SARS-CoV-2的敘利亞倉(cāng)鼠，大大降低病毒載量，預(yù)防肺損傷和病毒性肺炎^[3]。

2.洛啟生物——IL4R

哮喘是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，被世界衛(wèi)生組織列為疾病中四大頑癥之一，也成為僅次于癌癥的世界第二大致死和致殘疾病。哮喘的用藥包括靜脈、皮下、口服和吸入等方式，其中吸入給藥是最佳的給藥方式，能直達(dá)肺部病灶區(qū)，避免肝臟的首過效應(yīng)，減少系統(tǒng)性暴露毒性，規(guī)避皮下給藥的副作用。

2021年11月26日，洛啟生物宣布申報(bào)霧化液LQ036，一種靶向IL-4R的納米抗體創(chuàng)新藥。這是由洛啟生物自主研發(fā)的針對(duì)中重度哮喘治療的核心藥物，也是全球首款重度哮喘治療吸入式納米抗體藥物。洛啟生物的LQ036相比于阿斯利康的IL-4R吸入式骨架蛋白產(chǎn)品PRS-060，給藥頻率更低，活性更高。該藥有望為全球哮喘患者提供新的治療方案。

納米抗體口服遞送

對(duì)于慢性疾病，用藥的便利性是一個(gè)重要的評(píng)價(jià)因素和競(jìng)爭(zhēng)點(diǎn)，口服給藥不僅提高用藥的便利性，還能減少系統(tǒng)性的免疫抑制帶來的諸多毒副作用，前景可期。但是口服蛋白質(zhì)或者肽類藥物，需要克服胃酸、胃/胰蛋白酶、黏液屏障和上皮屏障重重困難，截止目前僅有少數(shù)的蛋白質(zhì)/多肽類藥物獲批。

1.口服遞送藥物V565

VHsquared公司從TNF-α免疫羊駝的納米抗體噬菌體文庫(kù)中，篩選獲得對(duì)胃腸道蛋白酶具有天然耐受性的TNF-α中和納米抗體，對(duì)其做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造以增強(qiáng)其抗蛋白酶水解的能力，最終得到分子V565。VHsquared公司對(duì)V565的劑型做了針對(duì)性的設(shè)計(jì)，將其制成口服的腸溶小片，開發(fā)用于局部治療炎癥性腸病（IBD）患者。

圖4 腸溶小片V565口服后在胃腸道中的溶解示意圖。

口服用藥時(shí)，膠囊殼在胃里很容易溶解，釋放出腸衣型V565微小藥片。這些藥片在低pH值下能抵抗溶解，并完整地通過幽門。當(dāng)V565微小藥片通過腸道時(shí)，pH值增加，引發(fā)腸溶包衣的溶解，使活性V565被釋放出來。在IBD患者中，V565將進(jìn)入腸道上皮損傷部位的發(fā)炎固有層，而過量的V565不會(huì)與腸道上皮結(jié)合，將通過淋巴被清除并進(jìn)入血液循環(huán)。https://doi.org/10.1080/03639045.2018.1542708.

體外蛋白酶耐受性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，V565對(duì)多種胃腸道溶液和金屬蛋白酶具有抵抗能力。V565的I期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示^[4]，V565分子在克羅恩病患者的組織中有明顯的高濃度分布。同時(shí)，口服7天后，活體組織切片中信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平降低約50%，顯示了藥物對(duì)TNFα相關(guān)的信號(hào)通路的抑制作用。

目前，V565正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)(NCT02976129)。抗體口服給藥的嘗試非常有意義，V565會(huì)有怎樣的進(jìn)展讓我們拭目以待。

2.口服遞送抗ETEC的納米抗體

致病性腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli ，ETEC) 是一種非侵入性病原體。ETEC可通過其表面的定植因子 (CF) 介導(dǎo)小腸粘附，一旦與小腸結(jié)合，細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致水樣腹瀉，據(jù)估計(jì)，ETEC在全球零星或流行性爆發(fā)期間每年會(huì)導(dǎo)致大約 380,000 人死亡。由于ETEC菌株的巨大異質(zhì)性，開發(fā)有效地覆蓋多種遺傳變異的 ETEC 菌株的疫苗非常具有挑戰(zhàn)性，目前為止還沒有獲批的ETEC預(yù)防型疫苗。

馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Wangyang團(tuán)隊(duì)^[5]通過免疫美洲駝，經(jīng)篩選獲得識(shí)別ETEC細(xì)菌表面的定植因子粘連素亞基 (CfaE) 的VHHs，體外實(shí)驗(yàn)中這些VHHs顯示出針對(duì) 11 種主要致病性 ETEC 菌株的交叉結(jié)合效力。

為了獲得最佳功能并提高VHHs在粘膜中的穩(wěn)定性，研究者將VHH設(shè)計(jì)成IgAFc融合抗體（VHH-IgA）給小鼠口服(圖5），發(fā)現(xiàn)VHH-IgA可以有效地降低小鼠腸道中的致病菌數(shù)量，并且效果優(yōu)于商業(yè)化的抗菌藥物Travelan^?（圖6）。Wang yang團(tuán)隊(duì)研發(fā)的可口服遞送的抗CfaE納米抗體對(duì)進(jìn)一步合理設(shè)計(jì)泛ETEC疫苗有實(shí)踐參考價(jià)值。

圖5 圖示VHH給藥的預(yù)處理方案。

在灌胃10E7CFU的H10407之前一或兩小時(shí)進(jìn)行VHH-IgA灌胃給藥。

圖6 2R215-mIhA2和1D7-mIgA2對(duì)致病菌的抑制效力優(yōu)于Travelan。

納米抗體跨血腦屏障遞送

血腦屏障（BBB）是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織，同時(shí)也阻止了大多數(shù)小分子藥物和大分子（例如肽，蛋白質(zhì)和基于基因的藥物）的轉(zhuǎn)移。

圖7 血腦屏障（BBB）結(jié)構(gòu)。https://cn.bing.com/images

血腦屏障是一把雙刃劍，雖能阻止有害物質(zhì)進(jìn)入我們的腦組織，卻也阻擋了治療藥物的進(jìn)入。它允許關(guān)鍵化合物通過幾種途徑從血液中選擇性地進(jìn)入大腦，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、信號(hào)分子和激素，包括被動(dòng)融合、受體介導(dǎo)的胞吞（RMT）、吸附介導(dǎo)的胞吞（AMT）和載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)（CMT）。

目前針對(duì)神經(jīng)中樞系統(tǒng)疾病治療的方法，如直接注射或破壞血腦屏障使其產(chǎn)生“漏洞”，具有感染、組織損傷和神經(jīng)毒性等風(fēng)險(xiǎn)，因此跨血腦屏障遞送藥物對(duì)相關(guān)疾病的治療具有重大意義。

圖8 大腦中受體介導(dǎo)的胞吞作用（RMT）和吸附介導(dǎo)的胞吞作用（AMT）過程的示意圖^[6]

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物必須克服血腦屏障，并在大腦中達(dá)到有效的濃度。一種很有前途的策略是通過胞吞作用(RMT)系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)輸，該系統(tǒng)使用靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）或胰島素受體（IR）的抗體作為載體，協(xié)助藥物穿過血腦屏障。對(duì)于這些策略，VHH顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有穿透血腦屏障后穿透腦實(shí)質(zhì)的顯著能力。研究表明，與傳統(tǒng)的單克隆抗體相比，VHH具有更小的體積，可以到達(dá)更深的腦組織，并具有更廣泛的腦暴露，而且具有更高的穩(wěn)定性。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了多個(gè)VHHs（表1，圖9），用于作為通過血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的載體或作為神經(jīng)成像工具。同時(shí)在朊病毒治療與阿爾茲海默癥治療上有明顯成效。

圖9 融合蛋白的結(jié)構(gòu)和特征。a：FC5與人Fc融合的分子結(jié)構(gòu)。b：融合蛋白：FC5作為攜帶藥理蛋白mGluR1的載體。c ：TfRMAb結(jié)構(gòu)域是血腦屏障傳遞的載體。d :HIRMAb與治療性蛋白抗AβscFv融合，用于治療阿爾茨海默病^[6]

1.納米抗體用于朊病毒治療的研究

朊病毒疾病，也被稱為傳染性海綿狀腦病（TSEs），參與了細(xì)胞朊病毒蛋白（PrPC）錯(cuò)誤折疊成與疾病相關(guān)的亞型癢病朊蛋白（PrPSC）。蛋白質(zhì)的沉積和聚集表現(xiàn)出神經(jīng)毒性，并導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)的海綿狀變化。研究人員^[2]從免疫駱駝構(gòu)建的噬菌體展示文庫(kù)中篩選出VHH PrioV3。經(jīng)過深入的研究表明，VHH PrioV3與PrPC和PrPSC的線性表位都有很高的結(jié)合能力。此外，整合細(xì)胞的免疫熒標(biāo)記顯示，PrioV3具有穿透細(xì)胞膜并與細(xì)胞質(zhì)PrPC結(jié)合的能力。它還能在體外穿過大鼠和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的人工血腦屏障，并在大鼠靜脈注射后在腦實(shí)質(zhì)中有效融合，證明了體內(nèi)穿過血腦屏障的特性。到達(dá)靶點(diǎn)后，PrioV3能完全展現(xiàn)出其藥理作用并且能廣泛消除PrPSC在朊病毒神經(jīng)元細(xì)胞中的復(fù)制。

2.納米抗體用于阿爾茲海默癥治療的研究

阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Aβ肽纖維的形成是AD中常見的生化特征，被認(rèn)為是一種假定的致病因素。研究靶向Aβ肽的VHHs，可用于開發(fā)新的治療方法。

研究人員從一個(gè)非免疫的、抗Aβ的噬菌體展示文庫(kù)中篩選出VHHs ni3A和ni8B[7]。隨后證明，兩種VHHs在體外比FC5（圖9）表現(xiàn)出更有效的血腦屏障交叉能力。在另一項(xiàng)關(guān)于這兩個(gè)VHHs的研究中，在框架區(qū)（FR1）中有三個(gè)氨基酸，ni3A表現(xiàn)出更高的遷移能力，說明氨基酸序列可能是其穿過BBB的關(guān)鍵。基于這一假設(shè)，該項(xiàng)目的研究人員將ni3A的FR1與另一個(gè)缺乏跨越血腦屏障能力的VHH va2E的CDR1-FR4結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)新的VHH 3A2E^[6]。隨后的體外血腦屏障傳代實(shí)驗(yàn)表明，新型VHH 3A2E相比VHH va2E具有更高的遷移率。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)在排除了年齡、疾病和高劑量導(dǎo)致血腦屏障中斷的可能性后證明了VHHs能夠在體外和AD小鼠模型中能夠穿過血腦屏障。

其他團(tuán)隊(duì)的研究人員^[8]從兩個(gè)免疫的噬菌體展示VHH文庫(kù)中篩選出靶向Aβ肽的VHH—R3VQ和靶向磷酸化tau蛋白的VHH—A2。研究發(fā)現(xiàn)，兩者都與大腦靶點(diǎn)的細(xì)胞外（淀粉樣斑塊）和細(xì)胞內(nèi)（神經(jīng)纖維纏結(jié)）有特異的結(jié)合。此外，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了VHHs能夠在體外穿過血腦屏障的能力并在靜脈注射的AD小鼠模型中，排除了年齡、疾病和高劑量導(dǎo)致血腦屏障中斷的可能性。雖然，VHHs的快速血液清除率和相對(duì)較高的腎臟潴留可能會(huì)損害體內(nèi)結(jié)果及其在治療中的應(yīng)用，但它們可以進(jìn)一步發(fā)展為很有前途的不同淀粉樣蛋白沉積的診斷工具。

小結(jié) 
傳統(tǒng)抗體給藥的方式受到限制，比較單一。相較于傳統(tǒng)抗體，納米抗體獨(dú)特的理化性能優(yōu)勢(shì)，使更多的給藥方式可通過其實(shí)現(xiàn)，相信隨著免疫療法和工藝技術(shù)的進(jìn)展，納米抗體藥物在未來將有更多的臨床應(yīng)用。

參考資料：

[1]Arghavan Soleimanizadeh, et al. Central Nervous System Delivery of Antibodies and Their Single-Domain Antibodies and Variable Fragment Derivatives with Focus on Intranasal Nose to Brain Administration.Antibodies 2021, 10, 47.

[2]Fangfang Chen, et al.Prospects of Neutralizing Nanobodies Against SARS-CoV-2.Frontiers in Immunology.2021;5.

[3]Zhang F, Wei H, Wang X, et al. Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade[J]. Cell discovery, 2017, 3(1): 1-12.

[4]Nurbhai, et al. Oral Anti-Tumour Necrosis Factor Domain Antibody V565 Provides High Intestinal Concentrations, and Reduces Markers of Inflammation in Ulcerative Colitis Patients. Sci Rep 9, 14042 (2019).

[5]Amcheslavsky A,et al. Anti-CfaE nanobodies provide broad cross-protection against major pathogenic enterotoxigenic Escherichia coli strains, with implications for vaccine design. Sci Rep. 2021 Feb 2;11(1):2751. doi: 10.1038/s41598-021-81895-0.

[6]Yang Gao, et al..Single domain antibody?based vectors in the delivery of biologics across the blood brain barrier: a review.Drug Delivery and Translational Research.2020;10.

[7]Li T, et al. Camelid single-domain antibodies: A versatile tool for in vivo imaging of extracellular and intracellular brain targets. J Control Release. 2016;243:1–10.

[8]Rutgers KS, et al. Diferential recognition of vas cular and parenchymal beta amyloid deposition. Neurobiol Aging.  2011;32(10):1774–83.

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