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前言

BiTE是一種雙特異性 T 細(xì)胞接合劑，已被開發(fā)為免疫治療分子。傳統(tǒng)的 T-cell engager（BiTE）構(gòu)建由兩個(gè)單鏈可變抗體片段（scFv）組成，分別靶向腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和T細(xì)胞標(biāo)記物。第一個(gè)scFv-BiTE，靶向CD3和CD19的Blinatumomab^?于2014年12月被FDA批準(zhǔn)用于治療白血病，但在使用BiTE治療實(shí)體腫瘤治療方面，容易引起嚴(yán)重脫靶等不良事件，效果不佳。為了克服傳統(tǒng) BiTE 的局限性，開發(fā)新的 BiTE 勢(shì)在必行，基于納米抗體的 BiTE （Nb-BiTE）就是這樣的候選者之一。本期小編給大家介紹一種增強(qiáng)T細(xì)胞免疫治療的新平臺(tái)—Nb-BiTE。該分子通過將 T 細(xì)胞和腫瘤靶標(biāo)結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，來增強(qiáng)免疫治療。

研究亮點(diǎn)

該項(xiàng)研究報(bào)道了一種由兩個(gè)Nb構(gòu)建的BiTE，分別靶向T細(xì)胞表面的CD3分子和實(shí)體腫瘤表面的CD105分子，目前關(guān)于兩個(gè)結(jié)構(gòu)均為Nb的BiTE少見報(bào)道。文中假設(shè)CD105-CD3/Nb-BiTE通過CD3 Nb末端與T細(xì)胞CD3抗原之間的特異性結(jié)合以及CD105 Nb特異識(shí)別和結(jié)合TAA，來觸發(fā)TCR/CD3復(fù)合物的構(gòu)型變化，從而啟動(dòng)膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活腫瘤特異性 T 細(xì)胞。這種激活會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

CD105-CD3/Nb-BiTE構(gòu)建及驗(yàn)證

采用hCD3和hCD105蛋白免疫健康的駱駝，收集PBMC后采用噬菌體展示平臺(tái)篩選Nb，將CD3 Nb和CD105 Nb的基因序列通過Gly4Ser連接在一起，形成CD105-CD3/Nb-BiTE，它可將T細(xì)胞重定向至腫瘤細(xì)胞和心血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1a）。以同種方式構(gòu)建TTE-CD3/Nb-BiTE，作為同型對(duì)照。通過PCR將Nb-BiTE克隆到質(zhì)粒中，電轉(zhuǎn)，表達(dá)，純化，成功表達(dá)出Nb-BiTE，SDS-PAGE顯示大小為35KD左右（圖1b）。

圖1 CD105-CD3/Nb-BiTE 的構(gòu)造和機(jī)理示意圖

CD105-CD3/Nb-BiTE作用機(jī)制的研究

為了驗(yàn)證CD105-CD3/Nb-BiTE與靶點(diǎn)的特異性結(jié)合，研究者將不同類型的細(xì)胞與CD105-CD3/Nb-BiTE混合孵育，并用PE偶聯(lián)的抗his單抗（Sigma-Aldrich，USA）對(duì)細(xì)胞表面的CD105-CD3/Nb-BiTE進(jìn)行染色。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，用PBS進(jìn)行空白對(duì)照，TTE-CD3/Nb-BiTE作為陰性對(duì)照，使用流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)CD105的細(xì)胞（如Bel7404 HepG2 TDVEC細(xì)胞）與CD105-CD3/Nb-BiTE有很高的結(jié)合率，而CD105陰性的細(xì)胞（如SCC9 293T細(xì)胞）則不與CD105-CD3/Nb-BiTE結(jié)合。值得注意的是，TTE-CD3/Nb-BiTE幾乎不與各種類型的細(xì)胞結(jié)合。這些結(jié)果表明，CD105-CD3/Nb-BiTE與靶點(diǎn)具有高度特異性結(jié)合(圖2)。

圖2 CD105-CD3/Nb-BiTE 與不同類型細(xì)胞結(jié)合流式圖

進(jìn)一步檢測(cè)CD105-CD3/Nb-BiTE是否具有激活T細(xì)胞并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。從體內(nèi)治療試驗(yàn)后的腫瘤中分離出T細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析這些細(xì)胞的表型變化。結(jié)果顯示，CD105-CD3/Nb-BiTE能夠促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)CD25和CD69分子，這兩個(gè)分子通常與T細(xì)胞的活化和增殖相關(guān)（圖3d和e）。此外，在一定效靶比（E:T=10:1）下，CD105-CD3/Nb-BiTE能夠以劑量依賴的方式增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)特定靶腫瘤細(xì)胞（Bel7404）的裂解作用，但對(duì)不表達(dá)CD105的293T細(xì)胞無影響（圖3f）。這表明CD105-CD3/Nb-BiTE的激活作用是特異性的，主要針對(duì)表達(dá)CD105的腫瘤細(xì)胞。CD105-CD3/Nb-BiTE還能促進(jìn)T細(xì)胞分泌幾種抗腫瘤細(xì)胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，并且這些細(xì)胞因子的含量可以通過酶聯(lián)免疫試劑盒在腫瘤細(xì)胞懸液中進(jìn)行測(cè)定（圖3g）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD105-CD3/Nb-BiTE對(duì)健康的 BALB/c 小鼠無組織毒性（圖3h）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了CD105-CD3/Nb-BiTE在免疫治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖3 CD105-CD3/Nb-BiTE激活T細(xì)胞并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

CD105-CD3/Nb-BiTE體內(nèi)藥效的評(píng)估

為了檢測(cè)CD105-CD3/Nb-BiTE的體內(nèi)藥效作用，通過皮下植入HepG2細(xì)胞，在NOD/SCID小鼠中建立癌細(xì)胞系來源的異種移植物（CDX）模型，五日后給藥。每天一次，連續(xù)五天經(jīng)尾靜脈向小鼠注射CD105-CD3/Nb-BiTE（10 μg）和人T細(xì)胞（4×107）的混合物，以評(píng)價(jià)其抗腫瘤療效（圖i）。統(tǒng)計(jì)小鼠存活數(shù)量后，制作接受治療至倫理終點(diǎn)（90天）的小鼠的Kaplan-Meier生存曲線（圖j）。第一次給藥后，測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算體積，后每三天測(cè)量一次。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，制作給藥后30天內(nèi)接受治療的小鼠的腫瘤體積分布圖（圖k）。

結(jié)果顯示，接受CD105-CD3/Nb-BiTE治療組小鼠比其它所有對(duì)照組存活時(shí)間都要長(zhǎng)，60%的小鼠到試驗(yàn)終點(diǎn)仍然存活。圖k表明，與其它對(duì)照組相比，CD105-CD3/Nb-BiTE是抑制腫瘤生長(zhǎng)的最佳藥物。

圖4 CD105-CD3/Nb-BiTE體內(nèi)藥效評(píng)估

小結(jié)

CD105-CD3/Nb-BiTE在體外和體內(nèi)均顯示出優(yōu)異的安全性和治療效果。這種雙特異性納米抗體BiTE，可能會(huì)成為促進(jìn)T細(xì)胞免疫治療的通用平臺(tái)。這歸因于納米抗體自身的優(yōu)勢(shì)，如體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、多功能性、易于設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，最重要的是，具有高特異性和安全性。

參考文獻(xiàn)：

Yang XM, Lin XD, Shi W, Xie SX, Huang XN, Yin SH, Jiang XB, Hammock BD, Xu ZP, Lu XL. Nanobody-based bispecific T-cell engager (Nb-BiTE): a new platform for enhanced T-cell immunotherapy. Signal Transduct Target Ther. 2023 Sep 4;8(1):328. doi: 10.1038/s41392-023-01523-3. PMID: 37661200; PMCID: PMC10475457.

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