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前言

噬菌體展示技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在生物技術(shù)領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。本指南詳細(xì)解答從構(gòu)建文庫到篩選抗體的技術(shù)實(shí)施中常見問題。通過優(yōu)化輔助噬菌體選擇、提高展示和轉(zhuǎn)化效率、設(shè)計(jì)高質(zhì)量引物，以及采用適當(dāng)?shù)目乖蔬f和篩選策略，研究人員可以顯著提升文庫質(zhì)量和篩選成功率。同時(shí)，避免篩選到非特異性抗體的方法和措施，進(jìn)一步保證了篩選結(jié)果的可靠性和實(shí)用性。

Q1. 噬菌體單價(jià)展示的本質(zhì)與目的？

A. 在噬菌體展示技術(shù)中，通常使用含有pⅢ噬菌粒展示載體的輔助噬菌體感染大腸桿菌以制備噬菌體顆粒。這些顆粒中的融合蛋白表達(dá)呈泊松分布，約90%的顆粒僅展示野生型pⅢ蛋白，少于10%的顆粒展示一個(gè)融合蛋白拷貝，展示多個(gè)拷貝的情況極少。因此，大多數(shù)展示融合蛋白以單價(jià)形式存在。

單價(jià)展示與多價(jià)展示相比，單價(jià)展示在篩選過程中，可以去掉弱結(jié)合的抗體。而多價(jià)展示由于存在avidity 效應(yīng)，會(huì)把弱結(jié)合的克隆也富集出來。

Q2. 常見輔助噬菌體差異與選擇

A. 含全長gⅢ的輔助噬菌體：

M13KO7、R408、VCSM13為含全長gⅢ的輔助噬菌體，也是最標(biāo)準(zhǔn)最常用的一類輔助噬菌體。M13KO7是M13噬菌體的一個(gè)突變體，帶有一個(gè)質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，卡那霉素抗性基因以及G6125T的突變基因Ⅱ。VCSM13是M13KO7的一個(gè)突變體。R408是f1噬菌體的一個(gè)突變體，帶有一個(gè)IRI的突變并且不帶抗生素抗性標(biāo)記基因，刪除了其IG中的24bp的區(qū)段從而使其包裝帶有完整信號(hào)的單鏈DNA優(yōu)于其自身單鏈DNA。使用這些含有全長gⅢ的輔助噬菌體超感染后產(chǎn)生的輔助噬菌體和重組噬菌粒顆粒的滴度高，目的蛋白的特異性強(qiáng)，但是由于這些輔助噬菌體基因組不具有包裝信號(hào)，展示水平也較低，可能會(huì)導(dǎo)致篩選特異性陽性克隆失敗。 

gⅢ刪除的輔助噬菌體：

M13MDD3.2、R408d3、VCSM13d3是通過分別刪除輔助噬菌體M13KO7、R408、VCSM13的gⅢ（1579-2851）而構(gòu)建的，再使用攜帶gⅢ的輔助質(zhì)粒提供pⅢ蛋白。這就使得噬菌體組裝時(shí)，pⅢ的唯一來源僅是由噬菌粒編碼的融合蛋白，由于絲狀噬菌體的pⅢ蛋白有3-5個(gè)拷貝，這在一定程度上提高的噬菌體的展示水平，但所展示蛋白的平均親和力降低了，而且這種輔助質(zhì)粒在一定程度上會(huì)造成污染，這就嚴(yán)重限制了刪除gⅢ的輔助噬菌體的使用。

gⅢ缺陷的輔助噬菌體：

hyperphage是最近由Rondot S等人從M13KO7基因組中刪除gⅢ的開放閱讀框（ORF)，僅保留啟動(dòng)子和信號(hào)肽，并在信號(hào)肽后加一個(gè)短肽，同時(shí)構(gòu)建大腸桿菌細(xì)胞包裝系（DH5α/pⅢ）來提供pⅢ蛋白的，這就避免完全刪除gⅢ帶來的極性效應(yīng)和污染的情況，提高了噬菌體產(chǎn)量，也使hyperphage的滴度大大提高。CT輔助噬菌體是刪除了VCSM13基因組上gⅢ的具感染力的N1和N2區(qū)而保留CT區(qū)，用輔助質(zhì)粒pUC19-gⅢ提供pⅢ蛋白。由于缺乏負(fù)責(zé)感染的N1和N2區(qū)，因此CT輔助噬菌體援救的重組噬菌體必須嵌入融合蛋白，才具有感染性。

輔助噬菌體Ex-phage、Phaberge、Ex12和VCSM13N1都在gⅢ中引入了琥珀終止密碼子，從而提供包裝效率。

Q3. 構(gòu)建高質(zhì)量噬菌體文庫的要點(diǎn)

A. 構(gòu)建高質(zhì)量展示文庫需要從以下5個(gè)方面進(jìn)行考慮：

①PBMC 總數(shù)（理論庫容）

PBMC是文庫的關(guān)鍵，其總數(shù)決定了我們需要構(gòu)建文庫的大小規(guī)模，同時(shí)也決定了文庫的多樣性。

②RNA 的質(zhì)量

 使用試劑盒提取RNA，確保高純度。

③抗體多樣性（germline 分布）

抗體多樣性是指引物能不能很好的覆蓋物種的germline分布，需要注意的地方是引物的設(shè)計(jì)與引物合成的質(zhì)量。

關(guān)于引物的設(shè)計(jì)a.可以根據(jù)germline的序列進(jìn)行設(shè)計(jì) b.需要考慮germline的表達(dá)豐度 c.盡量不要采用簡并引物，容易出現(xiàn)偏向性

關(guān)于引物的質(zhì)量：我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)的一些大廠為了追求方便與利潤，你要求PAGE或者HPLC純化，他們基本都是脫鹽，大家拿到引物后一定要先進(jìn)行測(cè)試。

④轉(zhuǎn)化子總數(shù)（library size）

轉(zhuǎn)化子總數(shù)決定了庫容的大小，一般要求庫容量是理論多樣性的10到100倍。需要注意的是轉(zhuǎn)化子的總數(shù)不等于文庫的多樣性。

⑤背景克隆比例

背景克隆是指沒有插入片段的克隆與讀碼框錯(cuò)誤的克隆，這類克隆生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過插入正確片段的克隆，導(dǎo)致文庫質(zhì)量降低。因此需要提高文庫的插入率與提高引物的質(zhì)量。

Q4. 如何提高文庫展示效率

A. 前面介紹到采用M13KO7的展示效率一般比較低，大約只有10%的噬菌體顆粒展示了抗體，90%都沒有展示。提高展示效率的方法包括添加誘導(dǎo)劑如IPGT誘導(dǎo)表達(dá)；或更換展示效率更高的輔助噬菌體如hyperphage 與Ex-phage等。

Q5. 如何提高大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率

A. 選擇高效率的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，能有效的提高大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率從而增加噬菌體文庫的庫容，在噬菌體展示文庫構(gòu)建過程中，使用比較多的感受態(tài)細(xì)胞有TG1、XL1-Blue、SS320等。在進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，要想獲得高的轉(zhuǎn)化效率，質(zhì)粒和連接產(chǎn)物的純度、電轉(zhuǎn)的條件、質(zhì)粒和連接產(chǎn)物的加入量以及操作的規(guī)范性也是尤為重要的。

Q6. 建庫引物設(shè)計(jì)原則

A. 引物長度為20-30個(gè)堿基，既能保證與目標(biāo)序列的結(jié)合，又能降低引物間的相互干擾。引物Tm值應(yīng)略高于目標(biāo)序列的解鏈溫度，以便在PCR過程中順利結(jié)合。引物的GC含量應(yīng)接近目標(biāo)序列的GC含量，以提高引物與目標(biāo)序列的結(jié)合效率。避免引物的自我互補(bǔ)，以免影響PCR擴(kuò)增效果。盡量不要選擇簡并引物。

Q7. 噬菌體文庫的保存方法

A. 不當(dāng)?shù)谋４娣椒〞?huì)降低噬菌體的效價(jià)，原則上噬菌體文庫在50%的甘油中低溫保存（-70℃以下）可以保存較長時(shí)間。

Q8. 抗原的呈遞方法及適用條件

A. 抗原的呈遞方法有直接包被的抗原呈遞、間接包被的抗原呈遞、通過完整細(xì)胞篩選的抗原呈遞等方法。直接包被的抗原呈遞適用于分子量較大，構(gòu)象穩(wěn)定的抗原，間接包被可用于直接包被效果較差，抗原分子量較小，表位難以充分暴露的靶分子，就可以借助生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)或者其他的標(biāo)簽分子進(jìn)行抗原的固定，提高抗原呈遞的效果。由于重組表達(dá)的抗原與細(xì)胞膜上的抗原構(gòu)象不一致，導(dǎo)致使用重組蛋白進(jìn)行篩選無法獲得結(jié)合細(xì)胞膜表面抗原的抗體時(shí)，我們可以采用HEK或CHO細(xì)胞構(gòu)建瞬轉(zhuǎn)或穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)細(xì)胞系，或高表達(dá)腫瘤細(xì)胞系，來呈遞抗原，使用細(xì)胞直接進(jìn)行篩選。

詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參閱公眾號(hào)文章--------噬菌體展示抗體篩選之抗原呈遞

Q9. 篩選方法

A.常見的篩選方法有正篩選，負(fù)篩選，競爭篩選，交叉篩選等。

正篩選是最基礎(chǔ)的篩選方式，直接篩選到結(jié)合靶蛋白的噬菌體抗體。

負(fù)篩選是針對(duì)性去除非特異性抗體的手段，在噬菌體抗體篩選過程中，靶抗原的標(biāo)簽與材料、與靶抗原結(jié)構(gòu)相似的抗原干擾等原因容易使我們篩選到非特異抗體，此時(shí)我們可以進(jìn)行負(fù)向篩選，提高篩選效率。

競爭篩選是將抗體與靶抗原和非靶抗原同時(shí)結(jié)合，可篩選到針對(duì)靶抗原親和力更高的抗體，同時(shí)扣除結(jié)合非靶抗原的部分抗體。

交叉篩選目的在于降低抗體富集的偏向性，主要針對(duì)不同物種之間的抗原，可以采用使用不同物種的同個(gè)抗原進(jìn)行交叉富集篩選，提高獲得交叉抗體的可能性。

詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)參閱公眾號(hào)文章--------噬菌體展示抗體篩選之篩選策略

Q10. 如何避免篩選到非特異性抗體

A. 在噬菌體篩選過程中，很多原因會(huì)導(dǎo)致篩選到非特異性抗體，針對(duì)不同的情況我們有不同的解決措施，例如，篩選到與抗原標(biāo)簽結(jié)合的非特異性抗體，我們可以選擇更換不同標(biāo)簽的抗原進(jìn)行篩選，或者進(jìn)行負(fù)篩選來降低非特異性抗體的比例。如果篩選到結(jié)合封閉液的抗體，我們可以選擇更換合適的封閉液，或者交叉使用不同的封閉液來避免這種情況。如果是篩選到識(shí)別背景細(xì)胞系（CHO或者HEK293)的抗體,可以更換不同的背景細(xì)胞系進(jìn)行篩選或者進(jìn)行負(fù)篩選。

Q11. 如何篩選得到多樣性好、高親和力的抗體

A. 靶分子的濃度，結(jié)合時(shí)間，洗滌強(qiáng)度不同可能都會(huì)導(dǎo)致篩選結(jié)果的差異，抗原和抗體結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，高親和力的抗體在較大的選擇壓力下也依然能夠與抗原有力的結(jié)合，因此我們可以采用增大選擇壓，如降低靶分子濃度，減少結(jié)合時(shí)間，增大洗滌強(qiáng)度來篩選更高親和力的抗體。相反，若想要獲得多樣性更好的抗體，我們需要減小選擇壓，尤其是在進(jìn)行第一輪篩選時(shí)能夠從構(gòu)建的文庫中盡量多地捕獲陽性克隆，才能保持文庫的多樣性，保證一輪的洗脫產(chǎn)物在10^4~10^7 之間，不能高于這個(gè)數(shù)量級(jí)也不能低于這個(gè)數(shù)量級(jí)。

Q12. 陽性克隆的檢測(cè)方法

A. 篩選獲得的噬菌體抗體經(jīng)過輔助噬菌體的包裝之后會(huì)在pⅢ蛋白上融合表達(dá)，我們就可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)或者流式細(xì)胞熒光分析技術(shù)（FACS)進(jìn)行檢測(cè)。

①Phage ELISA

phage ELISA是最常用的檢測(cè)方法，將抗原包被到酶標(biāo)板上，封閉之后加入噬菌體上清液，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13二抗，最后進(jìn)行顯色。一般情況下在OD450波長顯色值到達(dá)1.0以上我們認(rèn)為是陽性克隆。

②Phage FACS

利用流式細(xì)胞熒光分析術(shù)檢測(cè)噬菌體抗體與細(xì)胞的結(jié)合情況，噬菌體上清結(jié)合細(xì)胞之后再加入熒光標(biāo)記的抗M13二抗，根據(jù)熒光信號(hào)判斷檢測(cè)克隆是否為陽性克隆。

③細(xì)胞裂解液

由于M13噬菌體是絲狀的，非常長，容易粘連，導(dǎo)致非特異。對(duì)于天然文庫與合成文庫，盡量不要采用phage-ELSIA的方法進(jìn)行克隆驗(yàn)證，而是盡可能的利用TG1宿主菌20%的泄露表達(dá)，再采用噬菌粒上的標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)。

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