先導(dǎo)分子發(fā)現(xiàn)服務(wù)
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技術(shù)優(yōu)化服務(wù)
前言
過去30年間，納米抗體（Nbs)的研究迅猛發(fā)展。雖然大多數(shù)Nbs是經(jīng)駱駝科動(dòng)物免疫后篩選獲得，但近年來構(gòu)建的合成納米抗體庫在親和力和穩(wěn)定性方面展現(xiàn)出了生成高質(zhì)量納米抗體的潛力，這種合成方法相比使用動(dòng)物具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本期內(nèi)容介紹合成納米抗體文庫在設(shè)計(jì)過程中的考量因素。
合成文庫的優(yōu)勢與局限
優(yōu)勢：
1. 無需動(dòng)物免疫。
2. 適用于免疫原性弱或有毒的靶標(biāo)。
3. 可多項(xiàng)目共用一個(gè)合成文庫。
4. 獲得抗體周期更短。
5. 框架區(qū)具有優(yōu)化的物理化學(xué)性質(zhì)。
局限：
1. 需要大型文庫。
2. 親和力可能低于免疫文庫。
3. 框架區(qū)和可變區(qū)的組合存在穩(wěn)定性或可溶性較低的可能性。
框架選擇
Saerens及其同事們在合成納米抗體庫的發(fā)展中做出了開創(chuàng)性貢獻(xiàn)，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了第一個(gè)“通用”框架cAbBCII10，源自針對β-內(nèi)酰胺酶II的Nb。該框架因其高穩(wěn)定性、在細(xì)菌中的良好表達(dá)能力以及在缺乏典型二硫鍵的情況下仍能保持功能，至今廣泛應(yīng)用于新合成庫的設(shè)計(jì)中。
近年來，研究人員開發(fā)了新的策略來獲取高度穩(wěn)定的框架。這些框架不僅能夠支持各種CDR長度，在還原性環(huán)境（如細(xì)胞質(zhì)）中也能發(fā)揮功能，同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了人源化，而不會失去溶解度、穩(wěn)定性或親和力。
Nb框架選擇時(shí)需要考慮的因素：
· 框架設(shè)計(jì)策略：可基于不同Nb集合的共識序列，但結(jié)果需經(jīng)全面實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
· 溶解性和穩(wěn)定性：良好的溶解性避免高分子聚集物形成，穩(wěn)定的熔解溫度對各種化學(xué)反應(yīng)至關(guān)重要。
· 二硫鍵引入：非典型二硫鍵可顯著增強(qiáng)穩(wěn)定性，但可能影響表達(dá)水平，需針對性解決。
· 細(xì)胞表達(dá)水平：選擇高表達(dá)的框架對于實(shí)驗(yàn)室和大規(guī)模生產(chǎn)都至關(guān)重要。
· 免疫原性：Nb框架人類化可降低免疫原性，尤其適用于治療應(yīng)用和人體內(nèi)成像。
圖1 合成文庫的設(shè)計(jì)策略和期望的物理化學(xué)特性
框架區(qū)的優(yōu)化設(shè)計(jì)
框架區(qū)是納米抗體的骨干，決定其穩(wěn)定性和溶解性。優(yōu)化策略包括：
1. 選擇高穩(wěn)定性序列：挑選具有出色熱力學(xué)穩(wěn)定性的天然納米抗體序列。
2. 引入親和性增強(qiáng)突變：在框架區(qū)序列中引入有利于提高親和力的突變。
3. 優(yōu)化codon使用：根據(jù)宿主細(xì)胞的偏好調(diào)整序列，提高蛋白表達(dá)水平。
這些設(shè)計(jì)確保了框架區(qū)的優(yōu)異性能，為后續(xù)CDRs優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。
CDR區(qū)設(shè)計(jì)
CDR區(qū)的設(shè)計(jì)基于每個(gè)環(huán)的長度引入的不同設(shè)計(jì)。通常情況下，CDR1和CDR2的長度保持在5到8個(gè)氨基酸之間，而CDR3的長度則在6到18個(gè)氨基酸之間變化。設(shè)計(jì)中常見的策略是將CDR1和CDR2固定為特定長度，而CDR3可以設(shè)計(jì)為幾種不同長度。
在大多數(shù)情況下，CDR1和CDR2的設(shè)計(jì)遵循部分或完全隨機(jī)化的原則，以重現(xiàn)天然抗體庫中的氨基酸多樣性。相比之下，CDR3的常見做法是對每個(gè)位置進(jìn)行完全隨機(jī)化，允許所有20種天然氨基酸的出現(xiàn)，但通常會排除半胱氨酸，以避免二聚體形成、聚集或折疊問題的出現(xiàn)。
氨基酸的隨機(jī)化通常通過使用簡并密碼子來實(shí)現(xiàn)。例如，NNS或NNK簡并性編碼可以涵蓋20種天然氨基酸的總共32種密碼子。盡管這種方法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但其缺點(diǎn)是可能出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致截?cái)嗟臒o功能分子的產(chǎn)生。此外，高度的密碼子冗余可能導(dǎo)致某些氨基酸的偏向。為了精確控制隨機(jī)化，減少不需要的氨基酸出現(xiàn)的可能性，有時(shí)會采用精確但成本較高的三核苷酸DNA組裝方法。這種方法的主要優(yōu)勢在于可以精確地編碼所需的氨基酸，從而在每個(gè)位置上實(shí)現(xiàn)精確控制的隨機(jī)化。
表達(dá)系統(tǒng)
合成納米抗體庫構(gòu)建中一個(gè)關(guān)鍵問題是選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。目前，噬菌體展示是最常用的系統(tǒng)，其他系統(tǒng)包括核糖體展示和細(xì)胞展示（如酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌展示）。這些系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性和允許庫規(guī)模方面各有特點(diǎn)。
核糖體展示庫能夠提供極大的多樣性，達(dá)到10^12數(shù)量級，但操作復(fù)雜，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。噬菌體展示系統(tǒng)的庫規(guī)模約為10^9數(shù)量級，相比核糖體展示小三個(gè)數(shù)量級，但其操作簡便靈活，因此在科研中廣受歡迎。酵母展示庫的容量約為10^8，其優(yōu)勢在于可以通過流式細(xì)胞術(shù)對克隆進(jìn)行篩選。每種表達(dá)系統(tǒng)都有其獨(dú)特的優(yōu)勢和限制，研究人員需要根據(jù)具體需求和實(shí)驗(yàn)條件選擇最合適的系統(tǒng)。
理論多樣性與實(shí)際多樣性
豐富多樣性是合成庫設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，理論上恰當(dāng)?shù)目蚣苓x擇和精細(xì)的CDR設(shè)計(jì)可以篩選出穩(wěn)定且高親和力的納米抗體。然而，實(shí)際構(gòu)建的庫的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論值。若20個(gè)CDR位點(diǎn)進(jìn)行完全隨機(jī)化，理論組合數(shù)是20^20，約為10^26。而實(shí)驗(yàn)上能獲得的最大獨(dú)特序列數(shù)約為10^12，兩者之間差了14個(gè)數(shù)量級。盡管通過定制隨機(jī)化策略可以縮小這一差距，但理論庫與實(shí)際庫的多樣性差異仍然很大。這意味著，即使用相同的CDR設(shè)計(jì)多次構(gòu)建庫，每次得到的子庫都會有所不同。此外，即便使用天然存在的氨基酸進(jìn)行隨機(jī)化，也無法完全模仿天然庫的特性，因?yàn)樘烊粠斓亩鄻有圆粌H取決于每個(gè)位置的氨基酸類型，還包括這些氨基酸組合形成的整體結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)雜性。
小結(jié)
免疫庫一直是納米抗體的主要來源，然而，隨著合成庫不斷證明其作為穩(wěn)定、高親和力納米抗體替代來源的價(jià)值，且成本更低，速度更快，這種情況可能會有所改變。下期內(nèi)容將介紹已報(bào)道的多種合成納米抗體庫，并討論它們在構(gòu)建和驗(yàn)證中所采用的不同方法。
參考文獻(xiàn)：
Valdés-Tresanco, M.S.; Molina-Zapata, A.; Pose, A.G.; Moreno, E. Structural Insights into the Design of Synthetic Nanobody Libraries. Molecules 2022, 27, 2198. https://doi.org/10.3390/ molecules27072198
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