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2014年洛克菲勒大學(xué)大學(xué)Fridy等人開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一種名為Nano MiSeq/MS的新技術(shù)，該技術(shù)將二代測(cè)序（NGS）與質(zhì)譜相結(jié)合，以快速生成大量具有高親和力和特異性的納米抗體。

Fig.Overview of nanobodies produced by high-throughput sequencing and mass spectrometric identification.

該方法基本流程是分離免疫美洲駝的骨髓淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增VHH片段，并高通量DNA測(cè)序，獲得VHH蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合質(zhì)譜（MS）鑒定源自同一動(dòng)物血清的VHH片段。基于質(zhì)譜的數(shù)據(jù)在VHH蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配，從而獲得VHH序列信息。

在這種方法中，F(xiàn)ridy依據(jù)protein A和protein G對(duì)HCAb與傳統(tǒng)抗體（IgG1）親和力的不同，在美洲駝免疫后將含VHH的HCAb在血清中進(jìn)行連續(xù)分級(jí)（Hamers-Casterman等，1993）。然后將HCAb在抗原偶聯(lián)的樹(shù)脂上進(jìn)行親和純化，為了獲得高親和力VHH片段，嚴(yán)格控制洗滌條件，并在樹(shù)脂上用木瓜蛋白酶消化，以裂解掉恒定區(qū)，洗滌后回收VHH片段。將回收后的高親和力VHH片段采用胰蛋白酶消化和凝膠純化，并通過(guò)LTQ-Velos-Orbitrap質(zhì)譜分析。為創(chuàng)建抗原特異性的VHH序列蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，從免疫后的美洲駝分離淋巴細(xì)胞，并提取RNA與合成cDNA。采用巢式PCR特異性擴(kuò)增編碼VHH區(qū)的序列，以進(jìn)行高通量測(cè)序。 他們同時(shí)開(kāi)發(fā)了Llama Magic web server，利用計(jì)算機(jī)輔助快速搜索并匹配VHH序列。以GFP與mcherry為抗原進(jìn)行驗(yàn)證，針對(duì)GFP 共獲得25條VHH序列，mcherry 獲得5條VHH序列，經(jīng)過(guò)SPR驗(yàn)證，抗體親和力都在幾十nM~pM之間。利用同樣的方法，Shi Yi教授團(tuán)隊(duì)^2,3發(fā)表了多篇文章，證明了此方法高效與高通量。利用這項(xiàng)技術(shù)，作者確定了數(shù)千種高親和力anti-HSA NBs（NbHSA）。在這項(xiàng)研究中，作者制作并系統(tǒng)地描述了一系列用于藥物輸送的結(jié)構(gòu)多樣和亞納米親和性NBHSA。通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)開(kāi)發(fā)了一種多重藥代動(dòng)力學(xué)分析方法，并測(cè)定了幾十種被挑選出的NBHSA在Alb-/- FcRn人源化小鼠模型的半衰期。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HSA模型中，NBHSA具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)特征，半衰期從1.6天到7.6天不等。在弱酸性pH下，NbHSA的半衰期與其白蛋白結(jié)合親和力呈正相關(guān)。為了證明NBHSA的效用，作者通過(guò)將幾種跨物種的NBHSA與人白細(xì)胞介素-2融合，產(chǎn)生了“Duralukin”。Duralukin可以從大腸桿菌細(xì)胞中快速產(chǎn)生，具有良好的穩(wěn)定性和生物活性。利用黑色素瘤小鼠模型，作者證明了Duralukin對(duì)癌癥治療的高臨床前療效。

基于質(zhì)譜的納米抗體開(kāi)發(fā)，雖然具有非常高的通量，能夠通過(guò)控制洗脫條件（如高，低pH，鹽離子濃度等）獲得高親和力納米抗體，但這種方法只對(duì)簡(jiǎn)單的大分子比較高效，對(duì)于多次跨膜蛋白來(lái)說(shuō)，篩選效率低。其次成本高，需要配備質(zhì)譜，二代測(cè)序儀等昂貴儀器，難度系數(shù)大，操作復(fù)雜，不僅需要對(duì)血清進(jìn)行純化，獲得特異性多抗外，還需要質(zhì)譜與NGS分析，工作量巨大。最后獲得序列信息后，不能夠與表型統(tǒng)一，需要基因大量合成與表達(dá)驗(yàn)證，時(shí)間周期長(zhǎng)，成本高，因此該方法在業(yè)界并未大量使用。

參考文獻(xiàn)：

1. Fridy, P., Li, Y., Keegan, S. et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Methods 11, 1253–1260 (2014). https://doi.org/10.1038/nmeth.3170.

2. Xiang Y, Sang Z, Bitton L, Xu J, Liu Y, Schneidman-Duhovny D, Shi Y. Integrative proteomics identifies thousands of distinct, multi-epitope, and high-affinity nanobodies. Cell Syst. 2021 Mar 17;12(3):220-234.e9. doi:10.1016/j.cels.2021.01.003.

3. Yufei Xiang et al., (2020), Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2, Science, DOI: 10.1126/science.abe4747.

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