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前言

納米抗體由于其體積小、穩(wěn)定性優(yōu)良、親和力高和制備可行性強(qiáng)，已廣泛應(yīng)用于CAR-T中作為抗原結(jié)合域。基于納米抗體的CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)在十多個(gè)不同的腫瘤特異性靶點(diǎn)上顯示了良好的功能。得到的基于納米抗體的CAR-T或CAR-NK細(xì)胞在體內(nèi)外均顯示出抗腫瘤效果。納米抗體在CAR-T治療中的應(yīng)用已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室到床邊得到了很好的證明，并在形成更具挑戰(zhàn)性的先進(jìn)CAR-T方面顯示出巨大的潛力。

CARs發(fā)展簡(jiǎn)史 ^[1,2]

嵌合受體最早由Zelig Eshhar和Gideon Gross于1989年提出。他們將αβ-T細(xì)胞受體（TCR）的Vα和Vβ區(qū)域分別替換為抗體的VH和VL, 構(gòu)建生成一種人工嵌合TCR，其形式可以是VH-Cα/VL-Cβ或VL-Cα/VH-Cβ，如圖2所示。這種嵌合TCR，能夠以MHC非依賴性方式結(jié)合靶細(xì)胞并通過(guò)TCR機(jī)制激活細(xì)胞。

圖1. TCR、嵌合TCR以及不同代scFv作為CAR結(jié)構(gòu)域的示意圖^[2]。

現(xiàn)在所使用的CARs由四個(gè)組成部分組成：細(xì)胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域(包括單鏈抗體片段scFv或納米抗體VHH）；結(jié)構(gòu)成分，如鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域；提供維持CAR-T細(xì)胞效應(yīng)器功能的共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域，以及CD3ζ激活域。

第一代CAR只包含CD3ζ鏈信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。第一代CAR-T細(xì)胞雖然在體外和小鼠模型中可以特異性地殺死靶向腫瘤細(xì)胞，但是由于腫瘤細(xì)胞很少表達(dá)共刺激受體配體如B7，而第一代CAR也不具有共刺激受體結(jié)構(gòu)域，因此顯示出較低的細(xì)胞殺傷活性和體內(nèi)較短的存留期，不具備臨床上的有效性。

第二代CAR在跨膜序列和CD3ξ的ITAM域之間插入共刺激域，例如CD28、4-1BB或OX40。第二代CAR-T表現(xiàn)出優(yōu)化的T細(xì)胞激活、增加的體外抗原依賴性增殖、增強(qiáng)的體內(nèi)持久性和更有效的抗腫瘤活性。具有CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR目前已經(jīng)得到很好建立，三種FDA批準(zhǔn)的抗CD19 CAR-T細(xì)胞都基于這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。

第三代CAR則加入額外的共刺激域以進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的激活。典型胞內(nèi)域由CD28/4-1BB/CD3ξ 或CD28/OX40/CD3ξ組成。臨床試驗(yàn)表明，與第二代CAR相比，攜帶第三代CAR的CAR-T細(xì)胞展現(xiàn)出更強(qiáng)的擴(kuò)增和更長(zhǎng)的存活時(shí)間，尤其是對(duì)于病情輕微和正常B細(xì)胞水平較低的患者[3]。

第四代CAR添加分泌細(xì)胞因子或抗體能力，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境以增強(qiáng)其抗腫瘤活性。第四代CAR-T細(xì)胞將CAR-T細(xì)胞的直接抗腫瘤功能與腫瘤部位釋放細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)能力融合在一起，避免了系統(tǒng)性給藥引起的細(xì)胞因子不良影響，并且有望用于實(shí)體瘤的靶向治療。

第五代CAR是基于第二代CAR設(shè)計(jì)的，在其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域添加了細(xì)胞因子受體。

圖2. 細(xì)胞免疫治療從實(shí)驗(yàn)室到臨床的簡(jiǎn)要發(fā)展歷程^[2]。

納米抗體替代scFv作為CAR的靶向結(jié)構(gòu)域的優(yōu)勢(shì)

無(wú)聚集風(fēng)險(xiǎn)

scFv作為CAR容易在細(xì)胞表面聚集觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的激活和細(xì)胞毒性信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致T細(xì)胞枯竭。scFv高自聚集趨勢(shì)的主要原因有重鏈可變區(qū)上暴露的自由疏水殘基，和VH/VL區(qū)域不穩(wěn)定性折疊。相反，基于VHH的CAR-T細(xì)胞沒(méi)有這種風(fēng)險(xiǎn)。

圖3. CAR-T表面的scFv聚集示意圖^[1]。

導(dǎo)致scFv聚集在CAR-T表面上的兩種機(jī)制。第一種（左）稱為VH-VL錯(cuò)配，一個(gè)CAR的VL域與另一個(gè)CAR的VH域之間的配對(duì)。第二種（右）稱為VH-VH配對(duì)，一個(gè)CAR的VH域與另一個(gè)CAR的VH域發(fā)生配對(duì)。

低免疫原性

scFv結(jié)構(gòu)中連接VH和VL的連接肽序列，以及鼠源抗體的骨架序列，會(huì)導(dǎo)致免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，引起體內(nèi)產(chǎn)生抗藥物抗體（ADA）。ADA效應(yīng)可能會(huì)中和CAR-T細(xì)胞的功能，引起嚴(yán)重的副作用，CAR-T細(xì)胞丟失，甚至CAR-T治療失敗。與之相比，VHH不需要連接肽，并且VHH與人類VH（VH3基因家族）的序列相似性高達(dá)75-90％，因此免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)不太可能發(fā)生。

雙特異性CAR

scFv的結(jié)構(gòu)限制了構(gòu)建更復(fù)雜CAR的潛力。構(gòu)建雙特異性CAR時(shí)，兩個(gè)獨(dú)立scFv分子中VH和VL的交叉配對(duì)可能導(dǎo)致親和力降低，并且多個(gè)scFv插入基因的大小影響病毒包裝效率。VHH比容易出現(xiàn)錯(cuò)配的scFv更有利構(gòu)建為雙特異行CAR的靶向結(jié)構(gòu)域，而且轉(zhuǎn)染和病毒包裝的效率也要優(yōu)于scFV。

除了以上優(yōu)勢(shì)之外，VHH在抗原表位結(jié)合、溶解度和穩(wěn)定性方面也具有更有利的結(jié)構(gòu)。由于這些特性，VHH在開(kāi)發(fā)各種形式的CAR-T方面具有獨(dú)特的潛力。

圖4. scFv與VHH綜合對(duì)比。圖片來(lái)源https://doi.org/10.1186/s40364-021-00332-6

納米抗體在CAR-T治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展

基于納米抗體的CAR

圖5. 納米抗體作為靶向結(jié)構(gòu)域的CAR-T設(shè)計(jì)示意圖

BCMA是一種跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)因子，在B細(xì)胞成熟和分化成漿細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于惡性漿細(xì)胞表達(dá)BCMA水平較高，因此成為各種癌癥免疫治療的重要靶點(diǎn)。傳奇生物的西達(dá)基奧侖賽(Cilta-cel，研發(fā)代號(hào)：LCAR-B38M)于2022年獲FDA批準(zhǔn)，用于治療成人復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤(MM)，是中國(guó)首個(gè)獲FDA批準(zhǔn)的細(xì)胞治療產(chǎn)品，同時(shí)也是全球首款批準(zhǔn)的納米抗體作為靶向結(jié)構(gòu)域的CAR-T。

Cilta-cel采取獨(dú)特的二價(jià)納米抗體設(shè)計(jì)，臨床數(shù)據(jù)顯示，平均12.4個(gè)月隨訪期，總緩解率ORR高達(dá)97%，sCR高達(dá)67%，12個(gè)月無(wú)進(jìn)展生存率為77%，12個(gè)月總生存率為89%。Cilta-cel的批準(zhǔn)上市表明使用納米抗體開(kāi)發(fā)和制造雙特異性/二價(jià)CAR-T細(xì)胞是可行的。

除了已獲批的Cilta-cel使用了納米抗體作為CAR-T靶向結(jié)構(gòu)域外，目前，關(guān)于納米抗體CAR-T靶向結(jié)構(gòu)域的研究在多個(gè)熱門靶點(diǎn)均有涉及，包括VEGFR2、HER2、PSMA、TAG-72、GPC2、CD38、CD33、CD7、MUC1、EGFR、CD20、CD105、PD-L1和EIIIB等。

圖6. 使用納米抗體作為靶向結(jié)構(gòu)域的CAR-T靶點(diǎn)^[2]。

基于納米抗體的靶向模塊

UniCAR T細(xì)胞是一種基于CAR技術(shù)的改進(jìn)型T細(xì)胞治療方法。與傳統(tǒng)CAR T細(xì)胞不同的是，UniCAR T細(xì)胞并不直接與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，而是通過(guò)與靶向模塊結(jié)合重定向到特定的細(xì)胞表面抗原。由于納米抗體分子小，可以更容易地滲透到腫瘤組織中，制備和合成更加靈活，因此是很好的靶向模塊選擇。研究數(shù)據(jù)也表明基于雙價(jià)VHH的靶向模塊能夠?qū)⒈磉_(dá)UniCAR的T細(xì)胞重定向到表達(dá)EGFR抗原的低水平癌細(xì)胞^[4]。

圖7. 使用基于scFv、單價(jià)VHH和雙價(jià)VHH的靶向模塊來(lái)重定向表達(dá)UniCAR的T細(xì)胞，以靶向特定的目標(biāo)抗原^[1]。

自分泌納米抗體的CAR-T

目前全球已有多款CAR-T藥物獲批上市，但都是針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤，而實(shí)體腫瘤患者眾多，腫瘤局部微環(huán)境更復(fù)雜。第四代CAR-T有望通過(guò)自分泌抗體或細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)實(shí)體瘤腫瘤免疫微環(huán)境以增強(qiáng)其抗腫瘤活性。其中進(jìn)展最快的是上海細(xì)胞治療集團(tuán)自主研發(fā)的自分泌PD1納米抗體MSLN-CAR T細(xì)胞產(chǎn)品（BZD1901），于今年3月份獲批臨床。該產(chǎn)品通過(guò)靜脈輸注給藥，回輸?shù)腃AR-T細(xì)胞在識(shí)別腫瘤抗原后被激活，通過(guò)細(xì)胞毒性作用殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)釋放PD1納米抗體，與T細(xì)胞表面PD1進(jìn)行結(jié)合，阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)，改變抑制性的免疫微環(huán)境，發(fā)揮協(xié)同作用殺傷腫瘤細(xì)胞。

小結(jié)

納米抗體是細(xì)胞治療領(lǐng)域中一種新興的、可塑性強(qiáng)的工具。與傳統(tǒng)單鏈抗體相比，納米抗體更容易穿透腫瘤細(xì)胞，能夠更好地識(shí)別腫瘤靶點(diǎn)并產(chǎn)生抗腫瘤效果。納米抗體還可以被用來(lái)構(gòu)建多功能的CAR-T細(xì)胞，通過(guò)針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)，提高治療的療效和安全性。此外，納米抗體還可以作為UniCAR-T的靶向模塊，對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)和監(jiān)測(cè)。隨著對(duì)其研究的深入，相信納米抗體在細(xì)胞治療相關(guān)應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1].Safarzadeh Kozani P, Naseri A, Mirarefin SMJ, Salem F, Nikbakht M, Evazi Bakhshi S, Safarzadeh Kozani P. Nanobody-based CAR-T cells for cancer immunotherapy. Biomark Res. 2022 Apr 25;10(1):24. doi: 10.1186/s40364-022-00371-7. 

[2].Bao C, Gao Q, Li LL, Han L, Zhang B, Ding Y, Song Z, Zhang R, Zhang J, Wu XH. The Application of Nanobody in CAR-T Therapy. Biomolecules. 2021 Feb 8;11(2):238. doi: 10.3390/biom11020238. 

[3]. Ramos, C.A.; Rouce, R.; Robertson, C.S.; Reyna, A.; Narala, N.; Vyas, G.; Mehta, B.; Zhang, H.; Dakhova, O.; Carrum, G.; et al. In Vivo Fate and Activity of Second- versus Third-Generation CD19-Specifific CAR-T Cells in B Cell Non-Hodgkin’s Lymphomas.Mol. Ther. 2018, 26, 2727–2737.

[4]. Albert S, et al. From mono- to bivalent: improving theranostic properties of target modules for redirection of UniCAR T cells against EGFR-expressing tumor cells in vitro and in vivo. Oncotarget. 2018;9(39):25597–616.

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