前言
源自駝科動物重鏈抗體的VHH譜系基因與人類VH3家族顯示出高度序列同源性，但VHH域的抗原結合方式和CDR環(huán)結構與常規(guī)異源二聚體抗體有很大不同。這些差異包括較長的互補決定區(qū)H3（CDR-H3）環(huán)，框架2（FWR2）區(qū)的替代物，非規(guī)范二硫鍵等。它們被認為是VHH能夠在沒有配對輕鏈的情況下依然發(fā)揮抗原結合作用的原因所在。
盡管過去的研究已經(jīng)表明VHH中CDR環(huán)的結構特性，有助于理解VHH的CDR環(huán)構象和抗原相互作用，但我們對VHH中不同CDR-H3環(huán)構象的整體異質(zhì)性、其功能后果以及CDR-H3異質(zhì)性的起源的理解仍然有限。本期小編為大家?guī)黻P于塑造VHH域中獨特CDR-H3構象的解讀。
CDR-H3環(huán)的構象異質(zhì)性
由于單體性質(zhì)以及不同的CDR環(huán)構象，VHH域的抗原結合主要由CDR-H3環(huán)決定。研究表明，VHH抗體中存在結構上的極化。通過使用傳統(tǒng)雙鏈抗體的τ101和ɑ101角度，能夠將VHH結構分類為伸展(extended)或彎曲(kinked)CDR-H3的兩簇。彎曲CDR-H3構象的VHH占比大，其CDR-H3環(huán)更長，與FWR2的相互作用更多，是VHH抗體中典型的CDR-H3構象。而伸展的CDR-H3環(huán)長度平均較短，與框架的相互作用較少。
表1. 抗體的基因庫來源和框架組成在決定VHH抗體中CDR-H3環(huán)的構象和穩(wěn)定性方面起著至關重要的作用。
圖1. 基于CDR-H3環(huán)C端構象對VHH抗體的CDR-H3環(huán)進行聚類。
a 伸展（頂部，青色）和彎曲（底部，紅色）結構的CDR-H3的C端典型構象。黑色粗線突出顯示用于CDR-H3環(huán)分類的角度α101和τ101。
b 從lama和alpaca中的一組獨特VHH結構（n = 385）中α101和τ101角度的分布。
c CDR-H3區(qū)域聚類圖，伸展（頂部，青色）和彎曲（底部，紅色）。
譜系基因如何影響CDR-H3構象
研究發(fā)現(xiàn)，VHH抗體的CDR-H3構象與其來源的基因系譜密切相關。IGHV3-3基因衍生的抗體幾乎完全采用彎曲CDR-H3構象，而IGHV3S53基因衍生的抗體則大多采用伸展結構的CDR-H3環(huán)。彎曲結構的CDR-H3環(huán)比伸展結構更長，前者平均長度位為12個氨基酸，后者為9個氨基酸。
圖2. 兩類CDR-H3構象在其HV譜系基因使用上存在差異。
a 本研究中使用的VHH結構（n = 385）中最常見的7個VH譜系基因的使用情況。
b 來自IGHV3S53譜系基因的獨特VHH結構（n = 106）中的α101和τ101角度分布。
c 來自IGHV3-3譜系基因的獨特VHH結構（n = 175）中的α101和τ101角度分布。
d 兩個llama免疫庫VHH結構最常見的7個VH譜系基因的使用情況。
e 基于IGHV3-3（n = 13462，藍色）或IGHV3S53（n = 18769，橙色）譜系基因衍生的抗體CDR-H3氨基酸長度分布。
f Alphafold預測的來自IGHV3-3譜系基因的23個VHH序列（藍色）和來自IGHV3S53譜系基因的19個VHH序列（橙色）的α101和τ101角度。
VH基因與CDR-H3聚類之間的相關性與VDJ重組無關
CDR-H3環(huán)是由VH、DH和JH片段的組合編碼的。llama免疫庫測序數(shù)據(jù)研究顯示，盡管來自不同VH基因的抗體具有不同的CDR-H3構象，但其DH和JH基因的使用頻率幾乎相同，。而CDR-H3長度差異主要源于JH修剪和DH/NP片段長度的差異。因此，VDJ重組中的偏好并不能解釋CDR-H3環(huán)長度差異，而可能是B細胞發(fā)育過程中選擇的結果。
圖3. 兩只Llama 免疫庫中IGHV3-3和IGHV3S53衍生的VHH抗體的VDJ連接性質(zhì)。
a. IGHV3-3和IGHV3S53基因衍生的抗體IGHD片段使用情況。
b. IGHV3-3和IGHV3S53基因衍生的抗體IGHJ片段使用情況。
c. 抗體的Llama IgG2分布。
d. 直方圖顯示來自IGHV3-3（上方）和IGHV3S53基因（下方）的抗體中VH片段中最3'、端核苷酸位置的分布。
e. 來自IGHV3-3（n = 10304，藍色）或IGHV3S53（n = 14451，橙色）VH基因的抗體的NP核苷酸和D片段的核苷酸長度分布。
f. 直方圖顯示了來自IGHV3-3（上方）和IGHV3S53基因（下方）的抗體中IGHJ4片段中最5'端核苷酸位置的分布。
FWR2如何影響CDR-H3構象
FWR2通過影響FWR2與CDR-H3環(huán)之間的相互作用來影響CDR-H3構象。源自IGHV3-3基因的VHH結構具有更長且彎曲的CDR-H3構象，它們與疏水性FWR2之間相互作用更多，如pi-堆積相互作用和骨架相互作用，并且具有較長CDR-H3環(huán)的VHH不太容易聚集。相反，源自IGHV3S53基因的VHH結構具有較短CDR-H3環(huán)和伸展構象，并且與FWR2的相互作用較少，因為它們的親水性FWR2不易于提供彎曲CDR-H3構象所需的疏水支架。
彎曲和伸展CDR-H3的VHH結構在FWR2序列差異如下：
1.彎曲結構中FWR2的37和47位通常攜帶Phe，而伸展CDR-H3結構則在這些位置攜帶Tyr和Leu。
2.FWR2的44位在具有彎曲CDR-H3環(huán)的VHH結構中主要是Gln，而在伸展CDR-H3結構中該位置的保守性較低。
有研究表明，將具有彎曲CDR-H3的VHH移植到具有不同F(xiàn)WR2殘基的框架上會導致CDR-H3構象的變化和抗體熱穩(wěn)定性的降低，表明了FWR2對CDR-H3構象的直接影響。
圖4. 兩種結構性CDR-H3聚類的CDR-H3與FWR中序列和結構差異。
a 伸展CDR-H3結構（n = 100）和b 彎曲CDR-H3構象結構（n = 215）中CDR-H3和FWR2之間的接觸圖。藍色熱力圖表示特定殘基對在結構中相互作用的比例。使用Chothia編號方案對FWR2和CDR-H3位置進行編號，除了CDR位置95到100x，這些位置從C端對齊以顯示CDR-H3 C端的保守相互作用（詳見原文）。c 典型的伸展CDR-H3 VHH結構示意圖(PDB code 4LDE.A)。d 典型的彎曲CDR-H3 VHH結構（PDB代碼3K7U.A）示意圖。e 典型的彎曲CDR-H3 VHH結構（PDB代碼1U0Q.A）示意圖，CDR-H3中含有一個short 3–10 helix。CDR-H3和FWR中的關鍵殘基如棒狀表示。
具有伸展或彎曲CDR-H3環(huán)的VHH抗體在抗原結合方面的差異
CDR-H3環(huán)的構象影響抗原結合。VHH結構主要利用凸起結合模式，可能是為了彌補缺少輕鏈的情況。為了維持凸起的結合方式，具有伸展CDR-H3構象的VHH/抗原結構利用了暴露在溶劑中的FWR2進行抗原結合，而具有彎曲CDR-H3環(huán)的VHH結構則不太可能這樣做。結果是具有伸展CDR-H3環(huán)的抗體利用了更大的抗原結合區(qū)域。這種VHH的彎曲和伸展CDR-H3環(huán)之間的抗原結合差異已被先前指出，并用于設計核糖體展示文庫以使抗體結合模式多樣化。
圖5. 具有伸展CDR-H3環(huán)的VHH抗體的FWR2經(jīng)常參與抗原結合。
a 伸展（青色，n = 100）或彎曲（紅色，n = 215）CDR-H3的VHH結構中FWR2位置37、45和47的相對溶劑可接觸面積的箱線圖。b 不同VHH抗體結構中不同區(qū)域（FWR1-4、CDR-H1-3）與各自抗原發(fā)視相互作用的百分比，伸展CDR-H3構象的VHH（青色，n = 86）和彎曲CDR-H3構象的VHH（紅色，n = 162）。
圖6. 彎曲或伸展的CDR-H3構象的VHH抗體中不同區(qū)域的平均抗原表位貢獻。
小結
駝科動物中域抗體的起源尚不清楚，但VHH抗體可能與動物體內(nèi)常規(guī)VH/VL抗體共享其發(fā)展過程。駝科動物的VHH抗體表現(xiàn)出VH和JH片段的顯著偏向，但除了偏向基因使用外，研究發(fā)現(xiàn)CDR-H3環(huán)存在結構上的極化，具有截然不同CDR-H3構象簇。這兩種構象分別與VH基因的使用方式相關聯(lián)。在B細胞發(fā)育過程中的選擇壓力與FWR2的生物物理性質(zhì)共同塑造了VHH獨特的CDR-H3環(huán)的構象。這些研究工作不僅揭示了VHH抗體的結構多樣性，并且也為更好地理解譜系基因如何影響抗原相互作用、免疫庫的形成和工程設計提供了重要線索。
參考文獻：
Bahrami Dizicheh, Z., Chen, IL. & Koenig, P. VHH CDR-H3 conformation is determined by VH germline usage. Commun Biol 6, 864 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05241-y
了解更多納米抗體相關內(nèi)容，可關注<阿帕克生物>微信公眾號，獲取最新資訊~
先導分子發(fā)現(xiàn)服務
抗體制備服務
技術平臺
技術優(yōu)化服務
