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納米抗體(Nanobody or VHH)由３個高變區(qū)域的抗原互補決定區(qū) (complementarity determiningregions,CDRs)和４個框架區(qū)域 (frameworkregions,FRs)組成, 其序列和空間結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)抗體在以下方面的特征。

增加親水性氨基酸與較長的CDR1和CDR3

傳統(tǒng)抗體VH和VL通過疏水作用力來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并共同構(gòu)成抗原結(jié)合區(qū)。與之相比，VHH僅含有3個可變區(qū)，盡管與抗原結(jié)合界面的表面積減少，但其仍具有較高的穩(wěn)定性與親和力。它主要通過以下方式來適應輕鏈的缺失：

a. 大量的親水性氨基酸(圖b中黃色圓點）取代先前與CH1、VL結(jié)合界面的脂肪族殘基（L12S、V42F/Y、G49E、L50R/C、W52G/L），且部分FR2被拉伸扭轉(zhuǎn)的CDR3環(huán)覆蓋，避免與外界水環(huán)境的接觸，從而防止Nbs的二聚化，其CDR3環(huán)越長，Nbs越穩(wěn)定。另外還可在CDR3末端形成疏水核心，有利于穩(wěn)定Nbs的折疊結(jié)構(gòu)域。

b. VHH的CDR1和CDR3普遍比VH的長，潛在地增加了互補位構(gòu)象的多樣性，從而以高度的形狀表面互補性與相應的抗原結(jié)合，一定程度上彌補了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降以及因尺寸小而導致的潛在序列多樣性降低。增長的CDR１區(qū)域起源于種系基因，突變熱點的存在導致VHH向N 端延長。而較長的 CDR３區(qū)域可能是由于 V-D-J重組后功能性 VHH 域的選擇。

圖1. 重鏈抗體(a)與其可變結(jié)構(gòu)域(b)示意圖  

二硫鍵與 Nb穩(wěn)定性的關(guān)系

通過對比常規(guī)抗體與VHH的結(jié)構(gòu)可知，大部分VHH 序列是通過二硫鍵來約束長序列環(huán)從而解決由于CDR３區(qū)擴展可能引起的穩(wěn)定性問題。VHH中的二硫鍵類型分為保守和額外二硫鍵。幾乎所有的 VHH 序列有一個連接FR1（C23）和FR3（C104）的保守二硫鍵，該鍵跨越蛋白質(zhì)的內(nèi)部，將兩個β鏈連接起來，增加了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。部分VHHs還含有一個可限制CDR環(huán)柔韌性和構(gòu)象自由度的額外二硫鍵，且其位置與數(shù)量各不相同。研究表明，許多駱駝的VHH 序列在 CDR１區(qū)和 CDR３區(qū)中均包含一對額外的半胱氨酸(Cysteine,Cys)殘基，它們會形成環(huán)間二硫鍵。單峰駱駝的VHH 序列中的環(huán)間二硫鍵主要在 CDR１區(qū)和 CDR３區(qū)之間形成，而部分單峰駱駝的 VHH 序列則在CDR３區(qū)和CDR２區(qū)之間形成環(huán)間二硫鍵。

互補位構(gòu)象與抗原結(jié)合活性

研究表明，VHH CDRs的結(jié)構(gòu)多樣性高于傳統(tǒng)VH域。研究表明VHH的CDR1、CDR2、CDR3區(qū)所形成的的環(huán)高度可變，這些環(huán)在折疊蛋白結(jié)構(gòu)域的一側(cè)形成擴展的結(jié)構(gòu)界面，有利于形成抗原結(jié)合界面，非常適合插入對應抗原分子的溝槽或裂隙內(nèi)，增大與抗原的相互作用面積，從而產(chǎn)生了多種抗原結(jié)合特異性。 常規(guī)抗體的抗原結(jié)合片段呈凹陷或平面狀，只能識別抗原表面，而VHH包含１個主要由CDR３環(huán)組成的呈扁長形狀且暴露凸起的互補位，可以優(yōu)先識別裂口，并結(jié)合這些隱藏和凹陷的抗原表位，而常規(guī)抗體是難以識別這些表位。

近年來關(guān)于 VHH的相關(guān)研究為從微觀層面認識 Nb的優(yōu)良結(jié)構(gòu)基礎提供了理論依據(jù)。通過對VHH進行結(jié)構(gòu)表征，可指導 VHH定向改造，有望在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及基因工程方面進行更深層次的應用。

參考文獻：

1. Ciccarese S,et al. The Camel Adaptive Immune Receptors Repertoire as a Singular  Example of Structural and  Functional Genomics. Frontiers in Genetics. 2019.00997

2. Robert J Hoey, H, et al. Structure and development of single domain antibodies as modules for therapeutics and diagnostics. Experimental Biology and Medicine 2019; 244: 1568–1576

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