麻豆av有码在线观看-免费一区二区三区精品人妻-精品国产一区二区三区AV色诱-亚洲欧美在线综合一区二区三区-人妻少妇看a片偷人精品视频-在线观看免费不卡av-国产精品无毒不卡久久-裸体国模少妇精品视频-欧美亚洲中文字幕高清

自主超突變酵母表面展示（autonomous hypermutation yeast surface display，簡稱AHEAD^[1]）是一種利用酵母進(jìn)行抗體生產(chǎn)的方法，它模仿動(dòng)物體細(xì)胞超突變過程。通過在一種易錯(cuò)的正交DNA復(fù)制系統(tǒng)上編碼抗體片段或突變蛋白片段，表面展示的抗體庫通過酵母培養(yǎng)和富集的簡單周期持續(xù)突變，以進(jìn)行抗原結(jié)合。這樣，在短短兩周內(nèi)就可以產(chǎn)生高親和力克隆。這種方法為抗體發(fā)現(xiàn)或突變蛋白篩選提供了非凡的速度、簡單性和有效性。

AHEAD的本質(zhì)是利用了一套正交DNA復(fù)制系統(tǒng)，這是一種可以在不干擾宿主復(fù)制機(jī)制的情況下復(fù)制目的DNA的系統(tǒng)（圖一）。在該系統(tǒng)中存在兩種細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒：P1和P2，它們分別獨(dú)立編碼質(zhì)粒自我復(fù)制的DNA聚合酶TP-DNAP1和TP-DNAP2。對(duì)P1編碼的TP-DNAP1進(jìn)行改造后得到易出錯(cuò)的突變體TP-DNAP1^Y427A，將該突變體反式構(gòu)建于一個(gè)穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞核質(zhì)粒中（圖二），該細(xì)胞核質(zhì)粒表達(dá)出的DNA聚合酶TP-DNAP1^Y427A可以高突變的復(fù)制P1質(zhì)粒，但不提高宿主基因組的突變率^[2]。這會(huì)導(dǎo)致p1編碼的基因以每堿基10^-5次替換的突變率持續(xù)發(fā)生超突變，比酵母基因組每堿基10^-10次替換的基因組突變率高100,000倍。如果將抗體或突變蛋白的DNA片段構(gòu)建在p1上，酵母細(xì)胞會(huì)自我多樣化展示抗體蛋白，并自主探索序列空間。該系統(tǒng)的突變率可以通過對(duì)DNA聚合酶TP-DNAP1的改造而顯著增加，但不影響基因組復(fù)制，從而支持體內(nèi)連續(xù)進(jìn)化。該過程允許通過連續(xù)幾輪抗原結(jié)合分選來快速改進(jìn)抗體克隆(圖三)，從而在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高親和力、高質(zhì)量的抗體克隆。

圖一 正交復(fù)制系統(tǒng)模式圖

圖一 正交復(fù)制系統(tǒng)模式圖（正交系統(tǒng)的DNA聚合酶不會(huì)對(duì)宿主基因組的復(fù)制產(chǎn)生影響，正交系統(tǒng)的DNA合成和宿主基因組合成相互獨(dú)立）

圖二 正交復(fù)制系統(tǒng)質(zhì)粒p1/p2

圖二 正交復(fù)制系統(tǒng)質(zhì)粒p1/p2（將易突變的TP-DNAP1反式構(gòu)建于核粒中，表達(dá)的TP-DNAP1^Y427A可以復(fù)制p1質(zhì)粒，其中宿主基因組和核粒由宿主核酸聚合酶系統(tǒng)復(fù)制，不發(fā)生高突變，而p1質(zhì)粒由TP-DNAP1^Y427A復(fù)制，復(fù)制過程中發(fā)生高突變）

AHEAD系統(tǒng)的搭建和操作流程（圖三）

1. AHEAD系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建：首先搭建易出錯(cuò)的正交DNA復(fù)制系統(tǒng)，通過向酵母細(xì)胞中引入編碼易出錯(cuò)的DNA聚合酶的質(zhì)粒來實(shí)現(xiàn)，再將需要突變的目的片段插入高突變p1質(zhì)粒的特定位置。

2. 復(fù)制和突變：培養(yǎng)構(gòu)建的酵母細(xì)胞，易出錯(cuò)的DNA聚合酶在復(fù)制過程中會(huì)向目的DNA引入隨機(jī)突變，從而導(dǎo)致突變的DNA序列種群多樣化。

3. 選擇和富集：培養(yǎng)和富集酵母細(xì)胞以獲得所需的表型，例如抗原結(jié)合。使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行分類，分離出對(duì)抗原具有最高親和力的細(xì)胞。該過程允許選擇在DNA中具有突變的酵母細(xì)胞，從而改善抗原結(jié)合。

4. 質(zhì)粒提取和測(cè)序：從酵母細(xì)胞中提取含有抗體片段的質(zhì)粒，然后進(jìn)行下一代測(cè)序(NGS)，以鑒定抗體庫中發(fā)生的突變。

5. 迭代周期：該過程重復(fù)了幾個(gè)周期，每個(gè)周期都會(huì)在抗體庫中產(chǎn)生一組新的突變，這樣可以持續(xù)改進(jìn)抗體克隆。

6. 抗體生產(chǎn)：生產(chǎn)和純化高親和力抗體克隆，用于各種應(yīng)用。

總而言之，AHEAD過程涉及通過簡單的酵母培養(yǎng)和富集抗原結(jié)合周期，持續(xù)突變展示在酵母細(xì)胞表面的抗體庫。該過程允許在短短兩周內(nèi)快速生成高親和力抗體克隆。

圖三 自主超突變酵母表面展示（AHEAD）（p1質(zhì)粒中Ab表示抗體片段；DNAP表示DNA聚合酶；HA表示血凝素標(biāo)簽；Aga2為酵母錨定蛋白亞基；Trp1為色氨酸合成基因，實(shí)現(xiàn)p1質(zhì)粒的穩(wěn)定傳代）

AHEAD系統(tǒng)應(yīng)用于抗體親和力提升的案例

該系統(tǒng)被用來生成針對(duì)SARS-CoV-2 S糖蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體的強(qiáng)效納米抗體（圖四）。實(shí)驗(yàn)方法包括在p1上編碼抗體片段，并對(duì)其進(jìn)行連續(xù)的分選以進(jìn)行抗原結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，持續(xù)多樣化的抗體迅速得到改善，可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生高親和力、高質(zhì)量的抗體克隆。就SARS-CoV-2 S糖蛋白而言，AHEAD生成的納米抗體對(duì)病毒表現(xiàn)出強(qiáng)大的中和活性。與人免疫球蛋白G1（IgG1）抗體同型融合的抗RbD納米抗體對(duì)SARS-CoV-2偽型病毒顯示出卓越的中和效力，比其親本序列改善了約925倍。同時(shí)，AHEAD實(shí)驗(yàn)的并行性凸顯了保持每個(gè)親本克隆譜系分離的價(jià)值，因?yàn)樵缙趦?yōu)秀的家系可能無法超過最初表現(xiàn)不佳的譜系，而最初表現(xiàn)不佳的譜系卻可能最終產(chǎn)生最強(qiáng)大的中和抗體，比如在所有進(jìn)化的變異中，納米抗體RBD1i13和RBD11i12具有最強(qiáng)的病毒中和能力，但它們卻來自于中和能力相對(duì)較差的親本。

圖四 抗SARS-CoV-2納米抗體的進(jìn)化和活性（a、展示了一個(gè)抗SARS-CoV-2納米抗體（母本=RBD10）的親和力成熟過程，紅色多邊形為分選的門。b、展示了從不同母克隆開始進(jìn)行的八個(gè)獨(dú)立AHEAD實(shí)驗(yàn)中固定的納米抗體突變位置。c、展示了使用AHEAD進(jìn)化的選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體的SPR曲線和相關(guān)單價(jià)親和力。每個(gè)納米抗體都被測(cè)試為固定的Fc融合物，流過其中列出的RBD濃度，RU表示響應(yīng)單位。d、展示了假SARS-CoV-2病毒上選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體的中和活性，每個(gè)納米抗體濃度（x軸）都進(jìn)行了復(fù)測(cè)。n=6，誤差條代表±s.d.。e、展示了在存在使用AHEAD進(jìn)化的選擇性抗SARS-CoV-2納米抗體時(shí)，測(cè)量ACE2競(jìng)爭(zhēng)RBD結(jié)合的生物層干涉儀跟蹤。f、在每個(gè)母體納米體的親和力成熟過程中，從AHEAD的不同循環(huán)中分離出的納米體的親和力和中和效能的提高。每個(gè)填充圓圈代表一個(gè)納米抗體的親和力，相同顏色的空心圓圈代表納米抗體的中和效能。每個(gè)圓圈內(nèi)部的數(shù)字指定了從中分離出該納米抗體的AHEAD周期）

AHEAD系統(tǒng)應(yīng)用于天然文庫篩選的案例

AHEAD系統(tǒng)可以編碼各種天然抗體庫，充當(dāng)針對(duì)任意靶點(diǎn)生成抗體的現(xiàn)成庫，成功地從編碼在AHEAD上的天然納米抗體庫中篩選到了針對(duì)GFP的高親和力納米抗體。

總結(jié)

1. AHEAD的系統(tǒng)用于快速抗體進(jìn)化，該系統(tǒng)通過酵母生長和基于FACS的選擇使YSD納米抗體多樣化。2. 與自然的體細(xì)胞超突變不同，AHEAD缺乏突變熱點(diǎn)，但未來的版本可能會(huì)模仿突變熱點(diǎn)，并包括新的抗體支架和選擇方法。3. AHEAD被用來快速進(jìn)化出針對(duì)SARS-CoV-2的強(qiáng)效納米抗體，從從天然庫中分離出來的弱親和性納米抗體克隆，在短短1.5-3周的時(shí)間內(nèi)不間斷地進(jìn)化。4. AHEAD的抗體快速進(jìn)化核心功能應(yīng)該能夠?qū)崿F(xiàn)更廣泛的抗體開發(fā)工作。總體而言，AHEAD系統(tǒng)為簡化整個(gè)抗體生成提供了一個(gè)參考模板。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wellner, A., McMahon, C., Gilman, M.S.A. et al. Rapid generation of potent antibodies by autonomous hypermutation in yeast. Nat Chem Biol 17, 1057–1064 (2021).

[2] Ravikumar, A., Arrieta, A. & Liu, C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol 10, 175–177 (2014).

了解更多納米抗體相關(guān)內(nèi)容，可關(guān)注<阿帕克生物>微信公眾號(hào)，獲取最新資訊~