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前言  
目前國內(nèi)外有多家企業(yè)采用酵母表面展示技術(shù)用于抗體藥物發(fā)現(xiàn)，其中將該技術(shù)應(yīng)用最為深入廣泛的是Adimab公司。Adimab的核心技術(shù)是利用酵母平臺(tái)進(jìn)行抗體發(fā)現(xiàn)和抗體成熟工程。Adimab是全球唯一擁有商業(yè)化人源全長(zhǎng)抗體庫酵母展示技術(shù)平臺(tái)的公司，獨(dú)特的酵母技術(shù)使得Adimab成為了抗體藥開發(fā)領(lǐng)域的獨(dú)角獸企業(yè)，憑借這一特點(diǎn)，Adimab與各大知名藥企達(dá)成了合作，已經(jīng)幫助各大藥企完成超過55種臨床藥物的開發(fā)。信達(dá)生物包括信迪利單抗在內(nèi)的多個(gè)抗體藥產(chǎn)品都是來源于Adimab的酵母展示技術(shù)平臺(tái)。

本文將介紹目前已經(jīng)上市的應(yīng)用酵母展示技術(shù)開發(fā)的抗體藥物以及阿帕克生物使用酵母展示技術(shù)篩選納米抗體的經(jīng)典案例。

圖1 Adimab合作企業(yè)

應(yīng)用酵母展示技術(shù)開發(fā)的上市和臨床中的抗體藥物

1.信迪利單抗（Sintilimab）

2018年12月24日，信達(dá)生物制藥開發(fā)的創(chuàng)新藥物PD-1抑制劑達(dá)伯舒?（信迪利單抗注射液），被批準(zhǔn)用于治療經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤。

信迪利單抗是由酵母展示技術(shù)平臺(tái)開發(fā)出的PD-1抗體，能特異性結(jié)合T細(xì)胞表面的PD-1，阻斷導(dǎo)致腫瘤免疫耐受的 PD-1/ PD-L1通路，重新激活淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。

2.托萊西單抗 （Tafolecimab）

PCSK9是由肝臟產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，與肝細(xì)胞表面的LDL受體(LDL-R)結(jié)合，使LDL-R降解，血漿LDL-C水平升高。

目前有 9 款國產(chǎn)PCSK9單抗藥物在研，由信達(dá)生物利用酵母展示庫全人源抗體研發(fā)平臺(tái)研發(fā)的托萊西單抗是一種IgG2單克隆抗體，能特異性結(jié)合血漿中的游離PCSK9分子，通過減少PCSK9介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體（LDLR）內(nèi)吞來增加LDLR水平，繼而增加LDL-C清除，降低LDL-C水平。

托萊西單抗注射液獲得了“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)支持，是國內(nèi)首個(gè)PCSK9遞交新藥上市申請(qǐng)獲受理的，有望成為國內(nèi)首款獲批的自主研發(fā)的重組全人源抗PCSK-9單克隆抗體，擬開發(fā)用于治療非家族性高膽固醇血癥（non-FH）及雜合子家族性高膽固醇血癥（HeFH）等適應(yīng)癥。

3.CD47單抗（Letaplimab)

CD47是一種跨膜蛋白，它通過與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(SIRP)相結(jié)合，阻止巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

Letaplimab，也是來源于酵母展示庫全人源抗體技術(shù)，目前已在臨床Ⅱ期階段。Letaplimab能夠阻斷CD47與SIRP的結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，并促進(jìn)了T細(xì)胞的交叉激活。

臨床前數(shù)據(jù)顯示Letaplimab 作用靶點(diǎn)明確、作用機(jī)制清楚、藥效顯著。連續(xù)給藥4周，最高無嚴(yán)重毒性反應(yīng)劑量為100 mg/kg，每周一次，具有較好的安全性。1a期臨床數(shù)據(jù)顯示Letaplimab完成了所有預(yù)設(shè)劑量的爬坡，最高探索劑量為30mg/kg QW，各劑量組均未發(fā)生劑量限制性毒性，整體耐受性良好。

阿帕克生物應(yīng)用酵母展示技術(shù)在抗體藥物開發(fā)中的應(yīng)用介紹 

1.應(yīng)用酵母展示技術(shù)篩選中和抗體

PD-1是一種免疫檢查點(diǎn)抑制劑，主要由細(xì)胞表達(dá)的PD-L1激活。在癌癥中，PD-L1的表達(dá)是主要的免疫逃逸機(jī)制之一。此類免疫檢查點(diǎn)抑制劑的目標(biāo)是通過阻斷負(fù)通路來“釋放剎車”并增強(qiáng)T細(xì)胞活化，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的抵抗。

阿帕克生物使用Human PD-L1蛋白免疫羊駝后，制備納米抗體酵母表面展示文庫。通過磁珠篩選原始文庫，富集識(shí)別PD-L1的酵母細(xì)胞。再利用流式分選技術(shù)，分選具有PD1/PD-L1阻斷活性的酵母細(xì)胞群。再將分選到的克隆進(jìn)行測(cè)序和單克隆流式鑒定，確認(rèn)所得克隆為滿足要求的陽性克隆。PD-1中和抗體篩選策略詳細(xì)步驟可以參見《應(yīng)用酵母展示技術(shù)篩選阻斷活性抗體》一文。

2.識(shí)別同源蛋白獨(dú)特抗原表位的抗體篩選

當(dāng)靶點(diǎn)的同家族蛋白彼此同源性較高時(shí)，采用何種制備技術(shù)與篩選方法至關(guān)重要。以CD16a(FcγRIII)為例，帶您了解阿帕克生物如何應(yīng)用酵母表面展示技術(shù)篩選特異性識(shí)別CD16a的納米抗體。

CD16a(F176)/CD16a(V176)/CD16b同源性高達(dá)96%，噬菌體展示技術(shù)平臺(tái)很難篩選到特異識(shí)別CD16a，而不識(shí)別CD16b的納米抗體。但是應(yīng)用酵母表面展示技術(shù)，可以在每輪篩選結(jié)束后進(jìn)行FACS鑒定，并且直接分選特定群落的陽性抗體，獲得高特異性陽性克隆，以實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別CD16a抗體的篩選。
阿帕克生物使用CD16a(F176)、CD16a(V176)蛋白混合物免疫羊駝，制備納米抗體酵母展示文庫。對(duì)原始文庫進(jìn)行磁珠篩選與流式分選，最終分選出特異性識(shí)別CD16a的納米抗體。項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)和詳細(xì)篩選策略可以參見《酵母表面展示篩選特定表位納米抗體》一文。

3.相同表位抗體篩選

阿帕克生物利用酵母展示技術(shù)，采用對(duì)照抗體競(jìng)爭(zhēng)篩選的方法，可以實(shí)現(xiàn)識(shí)別特定表位納米抗體的篩選。

篩選策略首先采用X抗原進(jìn)行磁珠富集，將原始免疫文庫中識(shí)別X抗原的納米抗體富集出來（圖2），通過流式分選儀和對(duì)照抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)分選（圖3），將富集到的克隆進(jìn)行測(cè)序及單克隆流式鑒定，結(jié)果顯示獲得的大部分單克隆能夠與對(duì)照抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原(圖4)。

圖2 磁珠富集產(chǎn)物流式鑒定圖譜

左圖：未染色的細(xì)胞；

中圖：?jiǎn)稳颈磉_(dá)標(biāo)簽HA；

右圖：酵母展示抗體抗原X共孵育染色，流式分選得到G門中的細(xì)胞。

圖3 酵母展示抗體進(jìn)行抗原表位競(jìng)爭(zhēng)分選

橫軸為表達(dá)標(biāo)簽HA的熒光信號(hào)，縱軸為結(jié)合抗原X的熒光信號(hào)。

左一：未染色的細(xì)胞；

左二：?jiǎn)稳颈磉_(dá)標(biāo)簽HA；

左三：酵母展示抗體與抗原X共染色；

左四：酵母展示抗體與對(duì)照抗體，抗原X共孵育染色。

圖4 單克流式鑒定酵母展示抗體與抗原X結(jié)合

橫軸為表達(dá)標(biāo)簽HA的熒光信號(hào)，縱軸為結(jié)合抗原X的熒光信號(hào)。

酵母展示抗體與抗原X，共孵育染色。

圖5 單克隆流式鑒定酵母展示抗體與對(duì)照抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

橫軸為表達(dá)標(biāo)簽HA的熒光信號(hào)，縱軸為結(jié)合抗原X的熒光信號(hào)。

酵母展示抗體與抗原X，對(duì)照抗體，共孵育染色。

圖4與圖5對(duì)比可知獲得的大部分單克隆能夠與對(duì)照抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原。

結(jié)語

在酵母表面展示技術(shù)平臺(tái)中，由于可以采用流式分析技術(shù)對(duì)篩選過程精確控制，更能體現(xiàn)出應(yīng)用在抗體藥物發(fā)現(xiàn)過程中的優(yōu)勢(shì)。

參考資料：

1. Feldhaus, M., Siegel, R., Opresko, L. et al. Flow-cytometric isolation of human antibodies from a nonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library. Nat Biotechnol 21, 163–170 (2003). https://doi.org/10.1038/nbt785

2. McMahon C, Baier AS, et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 2018 Mar;25(3):289-296. doi: 10.1038/s41594-018-0028-6. Epub 2018 Feb 12. PMID: 29434346; PMCID: PMC5839991.

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