先導(dǎo)分子發(fā)現(xiàn)服務(wù)
抗體制備服務(wù)
技術(shù)平臺
技術(shù)優(yōu)化服務(wù)
前言
目前存在多種用于從免疫庫、合成庫或天然庫中鑒定抗體候選分子的展示技術(shù)，包括噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、哺乳動物細(xì)胞展示和酵母表面展示技術(shù)。酵母表面展示技術(shù)被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模抗體庫的篩選，并且已產(chǎn)生獲批的治療性抗體。盡管該技術(shù)在不斷進(jìn)步，但仍存在一個痛點，即將通過酵母展示發(fā)現(xiàn)的Fab片段重新構(gòu)建為全長IgG抗體的程序十分繁瑣（重新構(gòu)建為IgG是必需的，以發(fā)現(xiàn)抗體的全部活性和功能）。
為解決這一難題，研究人員開發(fā)了一種新型兩步克隆方法，用于將酵母表面展示的抗體庫平行轉(zhuǎn)移到哺乳動物雙向表達(dá)載體中，簡化了轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)步驟。該研究引入Golden Gate Cloning （GGC） 和雙向啟動子系統(tǒng)的方法，加快了從YSD Fab文庫到IgG生產(chǎn)的轉(zhuǎn)換，從而能夠更快地表征針對潛在治療應(yīng)用的各種靶標(biāo)的抗體。通過Golden Gate Cloning，將抗體編碼基因和Gal1/10啟動子插入到哺乳動物目的質(zhì)粒中，實現(xiàn)全長ORF的提取，從而在一個反應(yīng)中轉(zhuǎn)移整個結(jié)合分子群。這種方法可避免PCR介導(dǎo)的突變，同時維持重鏈-輕鏈的耦合，簡化了抗體候選物的批量重構(gòu)流程，加速發(fā)現(xiàn)過程。
圖1 從酵母展示載體到工程哺乳動物表達(dá)載體的批量重新格式化工作流程概述。
VH，重鏈可變結(jié)構(gòu)域；VL，輕鏈可變域；CLκ，輕鏈κ恒定域；GGC, Golden Gate Cloning；YSD，酵母表面展示；MD, mammalian destination；ORF，開放閱讀框；FACS，熒光激活流式分選。
主要研究內(nèi)容
本研究首先利用治療性抗PD-L1抗體Durvalumab進(jìn)行概念驗證實驗，以建立從酵母表面展示到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的重構(gòu)工作流程。
圖2 使用Durvalumab驗證概念驗證研究。
(A) FACS等值線圖，顯示與不含抗原的陰性對照（灰色）相比，Durvalumab Fab的展示及其結(jié)合生物素化PD-L1（藍(lán)色）的能力。x軸檢測抗體在酵母表面的展示，y軸檢測PD-L1結(jié)合。
(B)在Expi293-F細(xì)胞中產(chǎn)生的Durvalumab(上樣10 μg/ml)與PD-L1的親和力測定。
隨后，研究者從接受TAMR免疫的轉(zhuǎn)基因大鼠樣本中構(gòu)建了Fab抗體文庫，并利用這種精簡的方法對文庫進(jìn)行了篩選、重構(gòu)和表達(dá)純化。TAMR受體家族包括Tyro3、Axl和MerTK,屬于受體酪氨酸激酶家族，由于與多種疾病有關(guān)，十年來一直是研究熱點。通過NGS測序分析，獲得的抗體變體展現(xiàn)出合適的生物理化學(xué)性質(zhì)，并覆蓋了全部的VH多樣性。
實驗流程
免疫
將編碼TAMR靶標(biāo)的基因免疫接種到OmniRat中，待抗體水平達(dá)到足夠高時，提取其淋巴結(jié)和脾臟。
文庫構(gòu)建
從免疫后的組織中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后進(jìn)行兩輪嵌套PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，并引入酵母展示載體克隆所需的限制性內(nèi)切酶位點。采用Golden Gate克隆方法將擴(kuò)增產(chǎn)物與酵母載體連接，構(gòu)建Fab酵母展示文庫。
文庫篩選
利用FACS對酵母細(xì)胞進(jìn)行兩輪富集篩選（圖3）。第一輪使用TAMR-His6蛋白作為靶標(biāo)，第二輪使用TAMR-Fc蛋白。每輪結(jié)束后對富集池進(jìn)行質(zhì)粒提取。
圖3 TAMR酵母文庫的流式分選。
橫軸上描繪了與TAM受體的靶標(biāo)結(jié)合，分別使用針對TAMR-His或TAMR-Fc的抗His-AlexaFlour647綴合抗體或抗人IgG-PE綴合抗體。縱軸上顯示了表面展示信號，分別使用山羊F(ab’)2抗人Kappa-AlexaFluor647或-PE綴合物檢測。
NGS測序分析
對初始文庫和富集后兩輪的質(zhì)粒進(jìn)行VH/VL區(qū)域擴(kuò)增，并進(jìn)行NGS測序，分析抗體多樣性（圖4）。
圖4 第二輪篩選產(chǎn)物的NGS測序結(jié)果。
(A)第二輪排序后由VH和VL序列分隔的VH和VL序列的樹視圖。樹圖是使用Geneious Prime生成的。顏色編碼對應(yīng)于B中所示的10個單克隆中分離的VH/VL序列。
(B)表示在10個分離的克隆中發(fā)現(xiàn)的VH和VL。矩形代表VH簇，而橢圓形代表VL序列。
抗體重構(gòu)
從富集后的酵母質(zhì)粒池中，利用Golden Gate克隆將Fab片段直接重構(gòu)插入到哺乳動物雙向表達(dá)載體中，保留配對信息。
瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)
將重構(gòu)后的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至Expi293細(xì)胞中，進(jìn)行抗體表達(dá)。6天后收集細(xì)胞上清液。
抗體純化和表征
利用親和層析對目標(biāo)抗體進(jìn)行純化（圖5A），并進(jìn)行生物理化學(xué)表征，包括親和力（表1）、熱穩(wěn)定性和分子量（圖5B）等。
圖5 單克隆的表征。
(A)SEC圖譜和(B)還原條件下的SDS-PAGE分析，顯示各自的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的預(yù)期分子量。(A)中的曲線在x軸和y軸上分別微移1和10個數(shù)據(jù)單位。顏色編碼代表所識別的不同單克隆。
表1 使用His6-TAMR通過BLI測量確定純化的TAMR抗體的親和力
小結(jié)
該研究開發(fā)了一種簡單的重構(gòu)方法，利用Golden Gate克隆技術(shù)將從酵母展示系統(tǒng)富集的抗體文庫批量克隆到哺乳動物表達(dá)載體中，保留了重鏈-輕鏈的配對信息，大大減少實驗操作時間。雖然單鏈抗體存在缺陷，但利用Fab展示文庫進(jìn)行篩選更接近最終的抗原結(jié)合格式。
未來，該方法可與B細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合，保持天然重鏈-輕鏈配對。此外，該方法還可與其他展示技術(shù)相結(jié)合，充分發(fā)揮每種展示技術(shù)的優(yōu)勢，但不受其缺點的限制，例如，將噬菌體展示文庫的更大多樣性與酵母表面展示的高親和力抗體篩選結(jié)合起來，可以減少發(fā)現(xiàn)流程中的篩選步驟，或者構(gòu)建不同F(xiàn)c變體的載體池，為雙特異性抗體的發(fā)現(xiàn)做準(zhǔn)備。
綜上所述，該方法實現(xiàn)了從酵母展示到哺乳動物表達(dá)載體的高效重構(gòu)，提供一種更有效和簡化的方法，加快了抗體藥物的發(fā)現(xiàn)過程。
參考文獻(xiàn)：
Fiebig D, Bogen JP, Carrara SC, Deweid L, Zielonka S, Grzeschik J, Hock B, Kolmar H. Streamlining the Transition From Yeast Surface Display of Antibody Fragment Immune Libraries to the Production as IgG Format in Mammalian Cells. Front Bioeng Biotechnol. 2022 May 10;10:794389. doi: 10.3389/fbioe.2022.794389. PMID: 35620472; PMCID: PMC9127228.
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