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前言

目前單克隆抗體藥物主要采用CHO生產(chǎn)，但CHO生產(chǎn)昂貴且耗時，因此開發(fā)CHO替代生產(chǎn)系統(tǒng)十分有必要。基于酵母生產(chǎn)的單克隆抗體因快速、低成本和可擴展的發(fā)酵過程具有吸引力，但是酵母生產(chǎn)分泌IgG抗體仍然具有挑戰(zhàn)性，全長IgG抗體在畢赤酵母中的表達成功的案例僅有少數(shù)報道，并且大多數(shù)都涉及抗Her2抗體曲妥珠單抗（赫賽汀）。因此，研究者將目光聚焦在更為簡單的納米抗體(VHH)上，采用VHH-Fc這一表達形式驗證酵母生產(chǎn)IgG抗體的可行性。

VHH-Fc抗體表達設(shè)計

在前期研究中，研究者開發(fā)出可以同時中和SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的VHH。研究者將VHH與hIgG1 Fc融合在畢赤酵母中進行表達。為了進一步優(yōu)化在酵母菌中表達，研究者調(diào)整了hIgG1序列，包括截斷鉸鏈前5個氨基酸(EPKSC)以去除二硫鍵與常規(guī)全長抗體中的輕鏈結(jié)合、保留Fc C末端賴氨酸、進行N297A突變(糖型修飾)等，這種Fc改造產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)被稱為“（Pichia）FcGen1”（圖1A）。先前研究發(fā)現(xiàn)，糖鏈缺失會降低VHH-Fc分子穩(wěn)定性。通過在VHH-Fc的引入額外二硫鍵，可恢復(fù)或增加熱穩(wěn)定性。因此，研究者在CH2中引入R292C和V302C突變，以引入額外的二硫鍵，命名為“（Pichia）FcGen2”（圖1A）。

圖1. 在畢赤酵母中生產(chǎn)的Fc工程化VHH-Fc分子和理化性質(zhì)

VHH-Fc抗體表達和表征

隨后，設(shè)計的VHH Fc在畢赤酵母中生產(chǎn)并進行表征。為了擴大篩選的范圍，研究者從大量多樣的VHH開始，與兩種工程化的Fc構(gòu)建體（命名為“VHH1至6”）并行測試。首先，結(jié)果表明，向Fc中添加二硫鍵對分子的分泌性沒有明顯影響。可以使用protien A色譜法和排阻色譜法以足夠的產(chǎn)率純化Fc工程化分子。

采用質(zhì)譜（MS）鑒定了純化產(chǎn)物的分子組成（圖1D）。MS還揭示了O-甘露糖基化，以及N端Gln向Pyro-Glu的轉(zhuǎn)化（后者僅在VHH6中存在）。此外，還表征了分子的熱穩(wěn)定性，疏水性和聚集趨勢，因為這些是候選生物制劑開發(fā)中的關(guān)鍵屬性。正如預(yù)期的那樣，與FcGen2構(gòu)建體中存在的具有額外二硫鍵的分子相比， VHH-FcGen1顯示出熱穩(wěn)定性降低（圖1C）。在Fc區(qū)添加二硫鍵不會影響疏水性（圖1E）。值得注意的是，兩種畢赤酵母產(chǎn)生的Fc工程抗體的疏水性均低于CHO細胞生產(chǎn)的XVR011，這可能是因為由于CH2中不存在N-聚糖而形成了更緊湊的構(gòu)象（圖1E）。此外， FcGen2分子在加速實驗（40℃下10天）中顯示出較低的形成可溶性和/或不溶性聚集體的趨勢，與CHO細胞生產(chǎn)的N-糖基化XVR011相比，穩(wěn)定性相當或者更好（圖1F）。在高濃度PEG3350存在下，畢赤酵母產(chǎn)生的VHH Fc也顯示出降低的疏水性和聚集趨勢（圖1G）。總體而言，畢赤酵母產(chǎn)生的穩(wěn)定的非糖基化VHH-FcGen2顯示出理想的物理化學(xué)性質(zhì)。

繼續(xù)使用抗Covid（VHH1和VHH2）Fc工程化的VHH Fc分子進行體外藥效測試。不同畢赤酵母產(chǎn)生的VHH Fc變體與SARS-CoV-2 RBD和spike的結(jié)合，或體外中和效力均不受Fc工程改造的影響（圖2A-C）。與XVR011相比，畢赤酵母生產(chǎn)的VHH-Fc在ELISA上對SARS-CoV-2 RBD和spike蛋白顯示出更高的親和力，在VSV SARS-CoV-2 spike假病毒中和測定中的效力略高，并且在體外中和SARS-CoV-2病毒并減少斑塊形成方面具有類似的效力（圖2D）。此外，基于深度突變掃描，畢赤酵母生產(chǎn)的VHH2-FcGen2的識別表位與CHO細胞生產(chǎn)的XVR011的識別表位非常相似（圖2E）。

測試了VHH-Fc在倉鼠體內(nèi)中和SARS-CoV-2效力。在倉鼠感染后24小時腹膜內(nèi)注射1和4 mg/kg劑量的VHH1-FcGen2，VHH2-FcGen2或XVR011。對照動物注射4 mg/kg靶向呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗（Synagis）。除一個異常值外（由錯誤注射引起），在任何4 mg/kg VHH-Fc處理的倉鼠的肺勻漿中均未檢測到感染性病毒，（圖2F-G）。令人驚訝的是，VHH-Fc在1 mg/kg的較低劑量下也顯著降低感染性病毒的滴度，而XVR011則沒有。VHH2-FcGen2的體外效力比VHH1-FcGen2增加了兩倍，但并未轉(zhuǎn)化為更高的體內(nèi)效力。然而，與CHO細胞表達的XVR011相比，兩種畢赤酵母表達的VHH-Fc在1 mg/kg時肺部感染病毒水平降低更多。

圖2. 在畢赤酵母中生產(chǎn)的Fc工程化VHH-Fc分子的生物學(xué)活性檢測

總結(jié)

本文驗證了采用畢赤酵母表達VHH-Fc抗體的可行性，發(fā)現(xiàn)表達的VHH-Fc在穩(wěn)定性，聚集等理化性質(zhì)和體內(nèi)體外藥效上均有良好的表現(xiàn)。該項研究為后續(xù)采用畢赤酵母生產(chǎn)VHH-Fc，或生產(chǎn)IgG抗體提供了參考，有益于降低單克隆抗體藥物生產(chǎn)成本，推進單克隆抗體藥物的商業(yè)利用。

參考文獻：

Lonigro, C., et al. (2024). Yeast-based production platform for potent and stable heavy chain-only antibodies. https://doi.org/10.1101/2024.03.04.580093

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