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前言

釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 是生物技術(shù)領(lǐng)域中常用的微生物之一，因其在大規(guī)模生產(chǎn)、具有真核后翻譯修飾能力以及遺傳學(xué)良好表征等方面的優(yōu)勢，被廣泛用作異源蛋白表達(dá)的宿主。然而，許多異源蛋白在酵母中表達(dá)時(shí)面臨著進(jìn)入或有效通過分泌途徑的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致產(chǎn)量低下。同時(shí)，在蛋白質(zhì)工程中，酵母表面展示技術(shù)也因?qū)崿F(xiàn)高水平重組蛋白表達(dá)而備受關(guān)注。為了解決這些問題，科學(xué)家們開發(fā)了酵母模塊化克隆(MoClo)工具包，該工具包利用IIS型限制性內(nèi)切酶從標(biāo)準(zhǔn)化部分高效組裝表達(dá)載體。本文將介紹該工具包的擴(kuò)展及其在優(yōu)化釀酒酵母中異源蛋白分泌和表面展示中的應(yīng)用。

酵母中的蛋白質(zhì)分泌和表面展示

在釀酒酵母中，蛋白質(zhì)分泌通常由信號(hào)肽(SP)啟動(dòng)。SP通過后翻譯或共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(如Sec和SRP依賴途徑)將分泌蛋白引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)。信號(hào)肽包括帶正電荷的N區(qū)、疏水性α螺旋H區(qū)和含有切割位點(diǎn)的C區(qū)，這些區(qū)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的高效分泌至關(guān)重要。

除了蛋白質(zhì)分泌，酵母表面展示技術(shù)也在蛋白質(zhì)工程中有著廣泛應(yīng)用。表面展示技術(shù)通過將目標(biāo)蛋白質(zhì)錨定在酵母的細(xì)胞表面，使其能夠與外界環(huán)境相互作用。這對(duì)于抗體篩選、疫苗開發(fā)和酶工程等具有重要意義。然而，實(shí)現(xiàn)高效的表面展示也面臨諸多挑戰(zhàn)。

圖1. 構(gòu)建及組裝策略示意圖。

(A) 將不同類型的氨基端分泌促進(jìn)序列與目的蛋白和羧基端3xFLAG-6xHis標(biāo)簽結(jié)合,評(píng)估其分泌效率,或與HA表位標(biāo)記的錨定蛋白結(jié)合用于表面展示實(shí)驗(yàn)。
(B) 使用酵母模塊化克隆工具箱中的標(biāo)準(zhǔn)部件,評(píng)估一系列分泌促進(jìn)序列(SP)和轉(zhuǎn)錄因子蛋白(TFP)的酵母表達(dá)構(gòu)建體,除了3a'和3b'部件是通過自定義的突出序列(紅色文字)連接的。
(C) 類似的表達(dá)構(gòu)建體被用來評(píng)估酵母表面展示錨蛋白,它們被組裝為標(biāo)準(zhǔn)的4a部件類型,編碼有一個(gè)柔性連接子(GGGGSGGGGS)、一個(gè)HA表位標(biāo)簽和一個(gè)TEV蛋白酶切位點(diǎn),位于錨定蛋白的上游。
POI=目的蛋白

MoClo 工具包的擴(kuò)展

MoClo 工具包的工作原理是利用 IIS 型限制性內(nèi)切酶，通過標(biāo)準(zhǔn)化部分高效組裝表達(dá)載體。為了進(jìn)一步優(yōu)化異源蛋白分泌和表面展示，該研究擴(kuò)展了 MoClo 工具包，增加了16種信號(hào)肽 (SPs) 和翻譯融合伙伴 (TFPs)，以及5種表面展示錨定蛋白。這些擴(kuò)展部分經(jīng)過充分表征，可以更高效地引導(dǎo)異源蛋白通過酵母的分泌途徑，并實(shí)現(xiàn)高效的表面展示。

研究方法

在實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用五種不同的目標(biāo)蛋白，以驗(yàn)證分泌促進(jìn)信號(hào)的有效性。通過比較細(xì)胞內(nèi)和分泌蛋白水平，評(píng)估每個(gè)信號(hào)肽和翻譯融合伙伴對(duì)蛋白質(zhì)分泌效率的影響。此外，還研究了信號(hào)肽與表面展示錨定蛋白的組合，觀察其對(duì)表面展示效率的影響。

研究結(jié)果

研究結(jié)果顯示，不同的信號(hào)肽和翻譯融合伙伴對(duì)異源蛋白的分泌效率有顯著影響。對(duì)于每種目標(biāo)蛋白，最佳的分泌促進(jìn)序列各不相同。例如，某些信號(hào)肽對(duì)某些蛋白質(zhì)的分泌有顯著促進(jìn)作用，而對(duì)其他蛋白質(zhì)則效果不佳。

圖2. 評(píng)估一系列分泌促進(jìn)序列對(duì)納米抗體和mRuby2熒光蛋白表達(dá)的影響。

使用所示的分泌信號(hào)肽(SP)和轉(zhuǎn)錄因子蛋白(TFP)將重組蛋白靶向分泌。通過Western印跡檢測細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞沉淀物中的分泌和胞內(nèi)蛋白,并檢測羧基端6xHis標(biāo)簽。
(A) 利用所有SP和TFP,anti-GFP納米抗體都能很好地分泌(上圖),且可以從表達(dá)GFP的HEK293T細(xì)胞裂解物中捕獲GFP,證實(shí)其功能性(下圖)。
(B) 只有一半的SP和一個(gè)TFP能有效地促進(jìn)mRuby2熒光蛋白的分泌,這通過Western印跡(上圖)和對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行熒光測量(下圖)得到驗(yàn)證。
(C) 野生型和工程化的MFα前體-前體信號(hào)肽變體在促進(jìn)mRuby2分泌方面存在顯著差異,這通過Western印跡(左圖)得到證實(shí)。定量了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的蛋白水平(中圖),并計(jì)算了培養(yǎng)基與細(xì)胞沉淀物樣品中蛋白水平的比值,作為相對(duì)分泌效率的指標(biāo)(右圖)。分子量標(biāo)記的大小以kDa為單位標(biāo)示。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖3. 利用SP/TFP系統(tǒng)進(jìn)行甜味蛋白的重組生產(chǎn)。通過Western印跡評(píng)估重組甜味蛋白的表達(dá)和分泌情況,如前所示。

(A) 大部分但并非全部的SP和TFP能夠促進(jìn)brazein的適度分泌。
(B) 在促進(jìn)單鏈monellin最佳分泌的SP和TFP之間存在顯著差異。分子量標(biāo)記的大小以kDa為單位標(biāo)示。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽與表面展示錨定蛋白的組合對(duì)表面展示效率也有重要影響。一些特定的組合能夠顯著提高重組蛋白在酵母表面的展示水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，選擇合適的信號(hào)肽和錨定蛋白組合，對(duì)于實(shí)現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)分泌和表面展示至關(guān)重要。

圖4. 評(píng)估五種錨定蛋白用于anti-GFP納米抗體的表面展示。將anti-GFP納米抗體與所示錨定蛋白及AGA2前分泌信號(hào)肽(A)或MFαpp8前體-前體信號(hào)肽(B)一起在酵母細(xì)胞中表達(dá)。使用Alexa-488熒光素標(biāo)記的抗HA抗體或GFP蛋白結(jié)合的方式,通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估其表面展示。未轉(zhuǎn)化的BY4741細(xì)胞作為陰性對(duì)照。圖中顯示了FL1信號(hào)(Alexa-488或GFP熒光;Y軸)與前向散射(FSC;X軸)的關(guān)系,以及陽性染色細(xì)胞的百分比。

結(jié)論

通過擴(kuò)展酵母模塊化克隆 (MoClo) 工具包，研究人員提供了一組經(jīng)過充分表征的信號(hào)肽、翻譯融合伙伴及表面展示錨定蛋白。這些工具能夠幫助科學(xué)家高效篩選和優(yōu)化釀酒酵母中的異源蛋白分泌和表面展示。該研究突顯了使用 MoClo 工具包在蛋白質(zhì)工程中的優(yōu)勢，通過組合信號(hào)肽、翻譯融合伙伴和錨定蛋白，顯著提高了蛋白質(zhì)分泌效率和表面展示水平，為基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用提供了新可能性。

未來，隨著更多信號(hào)肽和錨定蛋白的發(fā)現(xiàn)和表征，MoClo 工具包有望進(jìn)一步擴(kuò)展和優(yōu)化，為生物技術(shù)領(lǐng)域帶來更多突破。這項(xiàng)研究展示了科學(xué)家在優(yōu)化酵母表達(dá)系統(tǒng)方面的努力和成果，預(yù)示著未來在生物制藥、疫苗開發(fā)和酶工程等多個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

參考文獻(xiàn)：

O'Riordan NM, Juri? V, O'Neill SK, Roche AP, Young PW. A Yeast Modular Cloning (MoClo) Toolkit Expansion for Optimization of Heterologous Protein Secretion and Surface Display in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol. 2024 Apr 19;13(4):1246-1258. doi: 10.1021/acssynbio.3c00743. Epub 2024 Mar 14. PMID: 38483353; PMCID: PMC11036508.

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