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前言
通過與酵母細胞壁蛋白融合表達，將目的重組蛋白展示在酵母表面蛋白的方法，稱為酵母表面展示。酵母表面展示技術(shù)已經(jīng)成為一種極具價值的蛋白質(zhì)工程工具，廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文將介紹酵母表面展示技術(shù)在蛋白工程中的應(yīng)用。

01親和力成熟

蛋白質(zhì)的親和力對其結(jié)合配體而言是一個關(guān)鍵參數(shù)，高親和力有利于調(diào)節(jié)結(jié)合復(fù)合物的生物學(xué)功能。目前，針對于蛋白質(zhì)親和力成熟的方法眾多，其中最為常見的是定向進化和分子展示技術(shù)。在過去的十年里，酵母表面展示技術(shù)逐漸成為親和力成熟的常用技術(shù)。

使用酵母表面展示的親和力成熟的策略主要包括4個步驟(圖1)：

圖1：通過FACS從酵母表面展示的文庫中分離高親和性蛋白質(zhì)突變體.^[1]

A. 文庫構(gòu)建：隨機誘變產(chǎn)生10⁷-10⁹個蛋白質(zhì)突變體的文庫;

B. 酵母表面展示：基因庫轉(zhuǎn)化酵母細胞和誘導(dǎo)表面表達，蛋白質(zhì)突變體表現(xiàn)為與Aga2p細胞壁蛋白的融合體；

C. 利用蛋白配體對展示文庫進行差異標(biāo)記（兩種策略）：平衡結(jié)合策略與動力學(xué)結(jié)合策略，蛋白質(zhì)突變體由于親和性不同而導(dǎo)致配體結(jié)合產(chǎn)生差異；

D. FACS篩選：添加經(jīng)熒光標(biāo)記的抗表位標(biāo)簽抗體可使酵母表面表達水平隨結(jié)合而正常化，從而可通過FACS分離出高親和性的突變體； 

經(jīng)分選的酵母克隆可擴增培養(yǎng)以用于分析或后續(xù)一輪分選，或可分離提取DNA，經(jīng)突變后用于轉(zhuǎn)化新批次的酵母細胞以進行進一步的蛋白定向進化，從而篩選出更高親和力的蛋白。

02蛋白穩(wěn)定性高
蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性通常是指其抵抗熱變性和化學(xué)變性以及蛋白水解降解的能力。高穩(wěn)定性是用于研究工業(yè)和治療應(yīng)用的蛋白質(zhì)的期望特征，同時穩(wěn)定性的提升可轉(zhuǎn)化為更長的保存期、活性持續(xù)時間和體內(nèi)活性。與結(jié)合親和力一樣，酵母表面展示技術(shù)可以在蛋白質(zhì)突變體仍與酵母細胞表面相連的情況下分析熱穩(wěn)定性，從而可以快速、定量地測定最大變性(TM)值。
目前，酵母平臺主要利用三種策略工程化增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(圖2)。三種方法均先通過隨機誘變產(chǎn)生約10⁷至10⁹個蛋白質(zhì)突變體文庫，并將其作為與Aga2p細胞壁蛋白的融合物進行酵母表面展示，隨后分策略進行高穩(wěn)定性蛋白質(zhì)的篩選。

圖2：通過FACS從酵母表面展示的文庫中分離高穩(wěn)定性蛋白質(zhì)突變體（點突變顯示為紅色）^[1]

策略一：根據(jù)表面表達水平篩選穩(wěn)定的蛋白質(zhì)突變體(圖2a)。用突變基因庫轉(zhuǎn)化酵母通常會顯示出適當(dāng)折疊和截短的蛋白質(zhì)突變體，其表達水平在一定范圍內(nèi)，可用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的替代物。用針對c - myc表位標(biāo)簽(紫色框)的熒光抗體(綠色星)和對酵母表面展示蛋白的天然折疊特異的配體(紅色星)標(biāo)記細胞，再通過FACS選擇表達最高水平的正確折疊突變體的細胞。

策略二：根據(jù)其抵抗不可逆熱變性的能力篩選穩(wěn)定的蛋白質(zhì)突變體(圖2b) 。在細胞分選前對酵母表面展示文庫進行高溫?zé)釕?yīng)激(85℃，10分鐘)。高溫?zé)嶙冃砸话銓儆诓豢赡孀冃裕蚀朔ǜm合于具有較高熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。基于其與熒光標(biāo)記的抗體或配體結(jié)合的能力，通過FACS分選出特異于天然蛋白質(zhì)折疊的，可抵抗熱變性的酵母表面展示的突變體。

策略三：利用升高溫度的優(yōu)勢和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的質(zhì)量控制機制來選擇穩(wěn)定的突變體。在該方法中，在高達37℃(與通常使用的20℃或30℃相比)的溫度下誘導(dǎo)表面展示的蛋白質(zhì)表達24小時，以在蛋白質(zhì)合成期間利用ER對蛋白質(zhì)的翻譯后處理，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的平衡向錯誤折疊狀態(tài)轉(zhuǎn)移，同時保持酵母細胞的活力。一般來說，只有在升高的誘導(dǎo)溫度下有效折疊和加工的蛋白質(zhì)才能避開ER質(zhì)量控制機制并有效地轉(zhuǎn)運到細胞表面。然后可以如第一種策略(圖2a)所述對文庫進行分類，以選擇穩(wěn)定性增加的突變體。

03蛋白酶定向進化

定向進化是改造酶特性的一項強有力的技術(shù)。然而，酶的定向進化過程中最大的挑戰(zhàn)則是將酶突變體的基因型與其表型(例如，催化活性或底物特異性)正確聯(lián)系，因為在大多數(shù)情況下，底物轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的是可擴散的產(chǎn)物，無法共價結(jié)合到噬菌體或細胞的表面，而酵母表面展示技術(shù)可將酶突變體與錨定蛋白如a-凝集素融合表達，而錨定于酵母細胞壁上。隨著酵母表面展示技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合FACS技術(shù)可以對包含10⁸個酶突變體的文庫進行篩選，獲得更高活性和底物特異性的酶。
其中，用于酶催化鄰近標(biāo)記的生物素連接酶TurboID就是通過酵母表面展示定向進化篩選獲得的。科學(xué)家Tess C. Branon等人^[2]以生物素連接酶BioID(BirA-R118S) 為模板，使用易錯PCR技術(shù)合成一個包含有10⁷個連接酶突變體的文庫，每個連接酶突變體平均有兩個氨基酸的突變。將該連接酶突變體文庫展示在酵母表面，加入生物素和ATP啟動雜交生物素化，然后用鏈霉親和素對每個酵母細胞表面的生物素化部位進行染色。通過流式分選富集高度自我生物素化的細胞（圖3）。
科學(xué)家通過這種酵母表面展示定向進化生物素連接酶，經(jīng)過多輪篩選最終獲得更高效率的生物素連接酶突變體TurboID和miniTurbo，這兩種酶使得酶催化標(biāo)記反應(yīng)可在10分鐘內(nèi)完成，大大縮短生物素標(biāo)記實驗周期且提高標(biāo)記效率。

圖3. 基于酵母表面展示定向進化的選擇方案。^[2]

連接酶與錨定蛋白Aga2p融合表達，Aga2p通過二硫鍵與Aga1p共價結(jié)合錨定在酵母表面。連接酶的C-末端帶有myc表達標(biāo)簽。將生物素和ATP加入到酵母庫中反應(yīng)10分鐘到24小時。藍色圓點所示為生物素化標(biāo)記的位點。用鏈霉親和素染色檢測底物的生物素化程度，用anti-myc抗體染色檢測連接酶的表達。FACS分選富集鏈霉親和素和Myc染色高比例的細胞。

小結(jié)    
與核糖體和噬菌體展示等其他技術(shù)相比，酵母表面展示的最顯著優(yōu)勢是可以結(jié)合流式細胞儀分析使用，能夠在細胞上定量測量蛋白表達水平、穩(wěn)定性、親和力和特異性，而不需要可溶性蛋白表達和純化等步驟。此外，酵母表面展示是真核表達系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生含有多個二硫鍵的復(fù)雜哺乳動物蛋白質(zhì)。這種獨特的優(yōu)勢組合使酵母表面展示技術(shù)成為應(yīng)用于蛋白改造中的領(lǐng)先技術(shù)。

阿帕克生物酵母表面展示技術(shù)平臺在蛋白改造中的應(yīng)用介紹

阿帕克生物專注于納米抗體研發(fā)，將酵母展示技術(shù)應(yīng)用于抗體發(fā)現(xiàn)及蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域，并提供抗體發(fā)現(xiàn)、抗體親和力成熟、T細胞受體親和力提高等服務(wù)，經(jīng)驗豐富，歡迎咨詢。

蛋白改造案例分享

1.IL-2：

白細胞介素2 (Interleukin 2，IL-2)是細胞因子的一種，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。它是一種負責(zé)調(diào)節(jié)白細胞（白細胞，通常是淋巴細胞）的免疫活性的蛋白質(zhì)。IL-2的生成是機體受微生物感染時免疫應(yīng)答的一部分，以區(qū)別“自己”與“非己”。IL-2通過與淋巴細胞表面的IL-2 受體（IL-2R）結(jié)合來發(fā)揮作用。

圖4：IL-2與IL-2R信號傳導(dǎo)通路

NK 細胞是唯一正常情況下表達 IL-2R 的淋巴樣細胞，因此始終對 IL-2 保持反應(yīng)性。然而非活化的 NK 細胞上只表達 IL-2R 的β鏈和γ鏈，對 IL-2 的親和力低，只對高濃度的 IL-2 發(fā)生反應(yīng)。一旦 NK 細胞活化，就表達 IL-2R 的α鏈，成為高親和力的受體；大劑量的 IL-2 能誘導(dǎo)出一種非特異性的殺傷細胞-LAK細胞（淋巴因子激活的殺傷細胞，lymphokine active killer cell)，可殺傷對NK細胞抵抗的腫瘤細胞。為了從文庫中篩選出與IL2-Rβ/γ相互作用，同時與IL2-Ra不識別或低親和的克隆，基于酵母表面展示平臺，我們在篩選策略上進行了針對性的調(diào)整。最終經(jīng)過幾輪篩選后，獲得目標(biāo)克隆。以下為野生型及篩選后的比對結(jié)果：

圖5：產(chǎn)物鑒定-同型對照（左：WT右：篩選對照）

圖6：產(chǎn)物鑒定-孵育Ra（左：WT ；右：篩選克隆鑒定）

圖7：產(chǎn)物鑒定-孵育Rb（左：WT ；右：篩選克隆鑒定）

最終經(jīng)單克隆鑒定，成功篩選得到與IL-2Ra不結(jié)合，并與IL-2Rβ/γ保持相互作用的克隆。

2. IL-18

細胞因子是在晚期癌癥患者中產(chǎn)生持久反應(yīng)的現(xiàn)代免疫療法，但它們只有適度的療效和有限的耐受性。研究表明白細胞介素-18（IL-18）通路的成分在腫瘤膨脹的淋巴細胞上上調(diào)，這說明IL-18治療可以增強抗腫瘤免疫。然而，有研究發(fā)現(xiàn)IL-18BP，一種高強度的IL-18誘餌受體，在不同的人類和小鼠腫瘤中經(jīng)常上調(diào)，并限制了IL-18在小鼠中的抗腫瘤活性。

圖8：IL-18BP可高強度結(jié)合白細胞介素-18

為了降低IL-18與IL-18BP的結(jié)合，需要通過改造，設(shè)計一種可抵抗IL-18BP，且保持信號傳導(dǎo)潛力，但不受IL-18BP抑制的影響的蛋白。

圖9：弱結(jié)合IL-18BP篩選示意流程圖

我們通過定向突變得到一個合成文庫，將合成的突變文庫誘導(dǎo)展示在酵母細胞上，進行幾輪篩選得到目標(biāo)克隆，最終分選得到幾乎不與IL-18BP結(jié)合的克隆，誘導(dǎo)其進行表達并對產(chǎn)物進行鑒定，結(jié)果如下：

圖10：產(chǎn)物鑒定結(jié)果Blank/同型對照/IL-18Ra與IL-18Rb染色/IL-18BP染色。

BP的陽性率（左四）與Ra的陽性率（左三）出現(xiàn)明顯差別，存在一群明顯不識別BP蛋白的細胞群，同時對Ra維持較高的結(jié)合。

參考資料：

[1]. Gerald M., et al.  Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Cell Surface Dispaly, Methods,Protocols, and Applications; Bin Liu, Ed.; Springer, 2015, pp.155-170. doi.10.1007/978-1-4939-2748-7_8

[2]. Branon, Tess C et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.Nature biotechnology vol. 36,9 (2018): 880-887. doi:10.1038/nbt.4201

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