麻豆av有码在线观看-免费一区二区三区精品人妻-精品国产一区二区三区AV色诱-亚洲欧美在线综合一区二区三区-人妻少妇看a片偷人精品视频-在线观看免费不卡av-国产精品无毒不卡久久-裸体国模少妇精品视频-欧美亚洲中文字幕高清

背景

CD19作為B細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，是用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤，如急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）和淋巴瘤的理想靶點(diǎn)。然而，CD19的細(xì)胞外域（ECD）容易聚集和錯(cuò)誤折疊，為開(kāi)發(fā)和分析CD19靶向治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)工程化改造，成功獲得穩(wěn)定的CD19-ECD（SuperFolder）變體，這些變體顯示出改善的表達(dá)率，并且與野生型蛋白相比，能夠有效地以單體形式純化。

研究方法

研究人員采用了酵母表面展示技術(shù)結(jié)合定向進(jìn)化策略，通過(guò)隨機(jī)突變和高通量篩選，從大量候選變體中篩選出穩(wěn)定性提高的CD19-ECD變體。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FACS）和熱穩(wěn)定性測(cè)試，對(duì)變體的穩(wěn)定性和表達(dá)特性進(jìn)行了評(píng)估。

初步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)四種不同的CD19-ECD構(gòu)建體，包括是否包含信號(hào)肽（SP）和外顯子5（E5），并通過(guò)抗標(biāo)簽抗體（anti-HA和anti-c-myc）及抗CD19抗體（FMC63和HIB19）進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不包含信號(hào)肽和外顯子5的構(gòu)建體表現(xiàn)最佳（圖1A）。

文庫(kù)構(gòu)建和篩選

利用錯(cuò)配PCR（error-prone PCR）對(duì)CD19-wt基因進(jìn)行隨機(jī)突變，生成初始文庫(kù)。隨后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FACS）進(jìn)行多輪篩選。每輪篩選中，細(xì)胞首先用抗HA抗體染色以標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平，然后根據(jù)與FMC63或anti-c-myc抗體的結(jié)合情況進(jìn)行選擇。在某些輪次中，額外加入48°C的熱孵育篩選步驟以增加選擇壓力，從而篩選出具有更高熱穩(wěn)定性的變體。

活性分析

在多輪篩選后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)最終篩選出的庫(kù)進(jìn)行分析。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面展示的CD19-ECD與抗體的結(jié)合情況，結(jié)果顯示篩選后的庫(kù)與初始的CD19-wt相比，表現(xiàn)出顯著改進(jìn)的折疊和穩(wěn)定性。

圖 1. 用于篩選CD19-ECD 穩(wěn)定變體的實(shí)驗(yàn)策略和酵母表面展示實(shí)驗(yàn)流程。(A) 酵母展示 CD19-ECD 的示意圖，檢測(cè)的四種不同 CD19-ECD 結(jié)構(gòu)與抗-HA 和抗-c-myc以及特異性針對(duì) CD19-ECD 結(jié)構(gòu)的單克隆抗體（FMC63 和 HIB19）的結(jié)合能力。(B) FACS篩選策略示意圖。(C) 酵母展示的 CD19-野生型和分選后庫(kù)比較。

研究結(jié)果

通過(guò)多輪篩選成功獲得了穩(wěn)定的、天然折疊的CD19-ECD變體。這些變體表現(xiàn)出更好的折疊性能和更高的熱穩(wěn)定性（圖2），并在HEK293細(xì)胞中顯示出更高的可溶性表達(dá)量（圖4）。

圖2 富集的SuperFolder變體表現(xiàn)出更好的結(jié)構(gòu)完整性和熱穩(wěn)定性。

圖3 SuperFolder突變?cè)贑D19-ECD結(jié)構(gòu)中的位置

圖4 可溶性表達(dá)SuperFolder變體產(chǎn)生單體蛋白

最佳突變體SF05的優(yōu)勢(shì)

1. 熱穩(wěn)定性和表達(dá)量：SF05變體在48°C測(cè)試中表現(xiàn)出顯著的熱穩(wěn)定性，并且在HEK293細(xì)胞中的可溶性表達(dá)量顯著高于野生型CD19。

2. 單體蛋白的純化：與野生型CD19不同，SF05變體能夠以單體形式高效純化，避免了蛋白質(zhì)聚集問(wèn)題。

3. 單價(jià)親和力分析：SF05變體用于分析在原代人T細(xì)胞上表達(dá)的CD19定向CAR（基于FMC63 scFv）的單價(jià)親和力，結(jié)果顯示其在檢測(cè)和表型分析方面具有極高的實(shí)用性。

4. CAR-T細(xì)胞檢測(cè)：SF05變體成功用于患者樣本中CAR-T細(xì)胞的檢測(cè)和表型分析，能夠通過(guò)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CAR-T細(xì)胞頻率的定量和CAR表達(dá)水平的分析。

圖 5. FMC63-CARs的單價(jià)親和力分析及患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的監(jiān)測(cè)。

小結(jié)

SuperFolder CD19-ECD變體的開(kāi)發(fā)，為癌癥免疫治療特別是在B細(xì)胞惡性腫瘤提供了新的工具。這些變體不僅可用于基礎(chǔ)免疫學(xué)研究，還有助于CD19靶向療法的開(kāi)發(fā)和監(jiān)測(cè)。特別是SF05變體，通過(guò)其與CD19-CAR的單價(jià)親和力研究，以及在淋巴瘤患者血液中CAR-T細(xì)胞的監(jiān)測(cè)和表征，證明了在臨床應(yīng)用中的潛力。

同時(shí)，該項(xiàng)研究成功展示了定向進(jìn)化和酵母表面展示技術(shù)的強(qiáng)大功能，不僅解決了CD19-ECD的穩(wěn)定性和表達(dá)問(wèn)題，還為其他"難以表達(dá)"的蛋白質(zhì)提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和啟示。

參考文獻(xiàn)：

Laurent E, Sieber A, Salzer B, Wachernig A, Seigner J, Lehner M, Geyeregger R, Kratzer B, J?ger U, Kunert R, Pickl WF, Traxlmayr MW. Directed Evolution of Stabilized Monomeric CD19 for Monovalent CAR Interaction Studies and Monitoring of CAR-T Cell Patients. ACS Synth Biol. 2021 May 21;10(5):1184-1198. doi: 10.1021/acssynbio.1c00010. Epub 2021 Apr 12. PMID: 33843201; PMCID: PMC8155657.

了解更多納米抗體相關(guān)內(nèi)容，可關(guān)注<阿帕克生物>微信公眾號(hào)，獲取最新資訊~